Här presenterar vi ett protokoll för att genetiskt modifiera primär eller utökad mänskliga naturliga mördarceller (NK) celler använder Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Med hjälp av detta protokoll, genererade vi mänskliga NK celler bristfällig för omvandla tillväxtfaktor – b receptor 2 (TGFBR2) och hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
CRISPR/Cas9 teknik accelererar genomet engineering i många celltyper, men hittills har gen leverans och stabil genmodifiering har varit utmanande i primära NK-celler. Till exempel resulterade transgenens leverans med hjälp av lentiviral eller retrovirala transduktion i en begränsad avkastning av genetiskt manipulerade NK-celler på grund av betydande förfarande-associerade NK cell apoptos. Vi beskriver här en DNA-fri metod för editering av mänskliga primära och utökade NK celler använder Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Denna metod får effektiv knockout TGFBR2 och HPRT1 gener i NK-celler. RT-PCR data visade en signifikant minskning i gen uttryck nivå, och en cytotoxicitet analys av en representativ cellen produkt föreslog att RNP-modifierade NK-celler blev mindre känslig för TGFβ. Genetiskt modifierade celler kan vara utökade post-elektroporation genom stimulering med bestrålat mbIL21-uttryckande feeder celler.
Immunterapi mot cancer har varit avancerade under de senaste åren. Genetiskt modifierade chimära antigen receptorn (bil) T-celler är ett utmärkt exempel på modifierade immunceller som distribuerats i cancer immunoterapi. Dessa celler har nyligen godkänts av FDA för behandling mot CD19 + B cell maligniteter, men framgången har hittills begränsats till sjukdomar med några targetable antigener, och inriktning på sådan begränsad antigena repertoarer är benägna att misslyckas immun flykten. Dessutom har CAR T-celler varit inriktad på användningen av autologa T-celler på grund av graft – versus – host sjukdom orsakas av allogena T-celler. I kontrast, NK-celler kan döda tumör mål på ett antigen-oberoende sätt och orsakar inte GvHD, vilket gör dem en bra kandidat för cancer immunoterapi6,7,8,9.
CRISPR/Cas9-teknik har använts nyligen i engineering immunceller, men genetiskt omprogrammering NK-celler med plasmider har alltid varit en utmaning. Detta har varit på grund av svårigheter i transgenens leverans på ett DNA beroende sätt såsom lentiviral och retrovirala transduktion orsakar betydande förfarande-associerade NK cell apoptos och begränsad produktion av genmanipulerade NK celler4 , 9.
Många medfödda immunceller uttrycka höga nivåer av receptorer för patogen-associerade molekylära mönster såsom Retinoic acid-inducerbara gen jag (RIG-jag), som gör det möjligt för förhöjd erkännande av främmande DNA. Dämpning av dessa vägar har aktiverat högre transduktion effektivitet i NK-celler när du använder DNA-baserade metoder för genetisk modifiering10.
Här beskriver vi metoden för att använda en DNA-fria gen editering av primära och utökade mänskliga NK celler utnyttja Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs består av tre komponenter, rekombinanta Cas9 protein komplex med syntetiska singel-guide RNA består av en komplex crRNA och tracerRNA. Dessa Cas9/RNPs klarar av att klyva genomisk mål med högre effektivitet jämfört med utländska DNA-beroende tillvägagångssätt på grund av deras leverans som funktionella komplex. Snabb clearance av Cas9/RNPs från cellerna kan dessutom minska de off-target effekterna såsom induktion av apoptos. De kan således användas för att generera knock-outs eller knock-ins när de kombineras med DNA för homolog rekombination6,7. Vi visade att elektroporation av Cas9/RNPs är en enkel och relativt effektiv metod som övervinner de tidigare begränsningarna av genetisk modifiering i NK-celler.
TGFβ är en större immunsuppressiva cytokin, som hämmar aktivering och funktioner av NK-celler. Det har föreslagits att inriktning TGFβ vägen kan öka immunceller funktioner. Vi riktade regionen kodning TGBR2 ectodomain som binder TGFβ11. De representativa resultat visar en signifikant minskning i nivån av mRNA-uttryck av denna gen och vidare Visa att de modifierade NK-cellerna bli resistenta mot TGFβ. Dessutom behålla modifierade cellerna livskraft och proliferativ potential, eftersom de kan vara utökade post-elektroporation använder bestrålat feeder celler. Därför följande metod är en lovande strategi att genetiskt manipulera NK-celler för någon ytterligare klinisk eller forskningsändamål.
DNA-beroende modifiering av NK-celler har utmanande4,9. Vi, därför infört direkt ett syntetiskt förformade ribonukleoprotein (RNPs) komplex och Cas9 protein som renat protein in i primära och utökade NK celler8. Denna metod tillät oss att eliminera tak, förföljer, och andra transkriptionell och translationell processer Startat av RNA-polymeras II, vilket kan orsaka NK cell apoptos är associerad med DNA-beroende transduktion metod…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Brian Tullius för hans vänliga hjälp i redigering manuskriptet.
RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
TGFβ | Biolegend | 580706 | |
Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |