جيل خلايا المغلوب الأساسية والموسعة ناغورني كاراباخ البشرية باستخدام ريبونوكليوبروتينس Cas9
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعديل الخلايا الأساسي أو الموسع البشرية القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) ريبونوكليوبروتينس Cas9 (Cas9/رنبس) باستخدام جينياً. باستخدام هذا البروتوكول، أنشأنا ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية قاصرة تحويل مستقبلات عامل النمو – ب 2 (TGFBR2) هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيراسي 1 (HPRT1).
Abstract
تسارع التكنولوجيا كريسبر/Cas9 هندسة الجينوم في العديد من أنواع الخلايا، ولكن حتى الآن، إيصال الجينات وتعديل الجينات مستقرة تحديا في الخلايا الأولية من ناغورني-كاراباخ. على سبيل المثال، أدت إلى تسليم التحوير باستخدام توصيل لينتيفيرال أو الفيروسات التراجعية عائد محدود من الخلايا ناغورني كاراباخ المهندسة وراثيا بسبب ناغورني كاراباخ المرتبطة بالإجراء كبيرة الخلية المبرمج. ونحن هنا وصف أسلوب خال من الحمض النووي للتحرير الجينوم البشري خلايا ناغورني كاراباخ الأساسية وتوسيع نطاق استخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين Cas9 (Cas9/رنبس). يسمح هذا الأسلوب كفاءة بالضربة القاضية TGFBR2 و HPRT1 الجينات في الخلايا ناغورني كاراباخ. RT-PCR البيانات أظهرت انخفاضا كبيرا في مستوى التعبير الجيني، واقترح الإنزيم سيتوتوكسيسيتي منتج خلية الممثل أن الخلايا المعدلة رنب ناغورني كاراباخ أصبح أقل حساسية ل TGFβ. يمكن أن تكون الخلايا المحورة وراثيا انهانسر وظيفة الموسعة بالتحفيز مع الإعراب عن mbIL21 المشع الخلايا المغذية.
Introduction
وقد طرحت المناعي السرطان في السنوات الأخيرة. خلايا تي مستقبلات (السيارات) مستضد تشيميريك المعدلة وراثيا مثال ممتاز لهندسة الخلايا المناعية بنجاح نشر في العلاج المناعي السرطان. هذه الخلايا وقد أقر مؤخرا إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج ضد CD19 + B خلايا الأورام الخبيثة، ولكن النجاح كان محدودا للأمراض آخذة المستضدات استهدافها قليلة حتى الآن، وتستهدف هذه المراجع مستضدي محدودة عرضه للفشل بالهروب محصنة. وعلاوة على ذلك، تركزت على استخدام خلايا تي ذاتي خلايا “تي السيارة” بسبب خطر الفساد – مقابل – المضيف الأمراض الناجمة عن خلايا تي متمكنة. في المقابل، ناغورني كاراباخ الخلايا قادرة على قتل الورم الأهداف بطريقة مستقلة عن مستضد ولا تسبب GvHD، مما يجعلها مرشح جيد للسرطان المناعي6،7،،من89.
تكنولوجيا كريسبر/Cas9 وقد استخدمت مؤخرا في هندسة الخلايا المناعية، ولكن وراثيا إعادة برمجة الخلايا ناغورني كاراباخ مع البلازميدات كانت دائماً صعبة. وكان هذا بسبب صعوبات في إيصال التحوير بطريقة تعتمد الحمض النووي مثل توصيل لينتيفيرال والفيروسات التراجعية يسبب الكبيرة المرتبطة بالإجراء ناغورني كاراباخ الخلية المبرمج ومحدودية إنتاج الخلايا المحورة وراثيا في ناغورني كاراباخ4 , 9.
العديد من الخلايا المناعية الفطرية التعبير عن مستويات عالية من مستقبلات لأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة مثل جين إيندوسيبلي-حمض الريتينويك أنا (تلاعب-أنا)، التي تمكن من الاعتراف المتزايد بالدنا الأجنبي. ومكن قمع هذه المسارات أعلى كفاءة توصيل في ناغورني كاراباخ الخلايا عند استخدام الأساليب القائمة على الحمض النووي للتعديل الوراثي10.
يصف لنا هنا طريقة استخدام خالية من الحمض النووي الجينوم التحرير من الابتدائي وتوسيع ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية استخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين Cas9 (Cas9/رنبس). Cas9/رنبس يتكون من ثلاثة مكونات، المؤتلف Cas9 البروتين الرصاصية مع الاصطناعية واحد-دليل الحمض النووي الريبي يتألف كرنا الرصاصية وتراسيرنا. هذه Cas9/رنبس قادرون ناهضة أهداف الجينوم بكفاءة أعلى بالمقارنة مع النهج المعتمدة على الحمض النووي الأجنبي سبب إيصالها كالمجمعات الفنية. بالإضافة إلى ذلك، قد تقلل التخليص السريع من Cas9/رنبس من الخلايا آثار خارج الهدف مثل تنظيم دورات تعريفية للمبرمج. وهكذا، يمكن استخدامها لإنشاء طرق الرافضة، أو الوظائف الإضافية تدق عندما جنبا إلى جنب مع الحمض النووي جزئ مثلى6،7. لقد أظهرنا أن انهانسر Cas9/رنبس هو طريقة سهلة وفعالة نسبيا أن يتغلب على القيود السابقة للتعديل الوراثي في الخلايا ناغورني-كاراباخ.
TGFβ هو سيتوكين كآبته رئيسية، مما يحول دون تفعيل ووظائف خلايا ناغورني كاراباخ. يقترح أن الاستهداف في مسار TGFβ يمكن زيادة وظائف الخلايا المناعية. نحن استهدفت منطقة ترميز اكتودومين TGBR2 الذي يربط TGFβ11. نتائج تمثيلية تظهر انخفاضا كبيرا في مستوى التعبير مرناً لهذه الجينات وكذلك إثبات أن الخلايا ناغورني كاراباخ تعديل تصبح مقاومة ل TGFβ. وبالإضافة إلى ذلك، تحتفظ الخلايا المحورة البقاء وإمكانات التكاثري، كما أنها قادرة على أن تكون وظيفة-انهانسر الموسعة باستخدام الخلايا المغذية المشع. ولذلك، الأسلوب التالي نهجاً واعداً للتلاعب وراثيا ناغورني كاراباخ الخلايا لأي زيادة السريرية أو لأغراض البحث.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم الطعن في التعديل تعتمد على الحمض النووي للخلايا ناغورني كاراباخ4،9. نحن، ولذلك، أدخلت مباشرة مجمع صناعي بريفورميد ribonucleoprotein (رنبس) والبروتين Cas9 كالبروتين المنقي الابتدائي وتوسيع نطاق الخلايا ناغورني كاراباخ8. هذا الأسلوب يسمح لنا بالقضا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف توليوس ريان لمساعدته الكريمة في تحرير المخطوطة.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
Riferimenti
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Ricerca sul cancro. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
