Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Hier presenteren we een protocol om genetisch wijzigen van primaire of uitgebreide menselijke natural killer (NK) cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Met behulp van dit protocol, we genereerden menselijke NK cellen tekort voor Transformeren groeifactor-b receptor 2 (TGFBR2) en hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 technologie versnelt genoom engineering in vele celtypes, maar tot dusver, gene levering en stabiele genetische modificatie geweest uitdagende in primaire NK-cellen. Bijvoorbeeld resulteerde transgenic levering met behulp van lentivirale of retrovirale transductie in een beperkte opbrengst van genetisch gemanipuleerde NK cellen als gevolg van substantiële procedure-geassocieerde NK cellen apoptosis. Hier beschrijven we een DNA-gratis methode voor het bewerken van het genoom van menselijke primaire en uitgebreide NK cellen met behulp van Cas9 ribonucleoprotein complexen (Cas9/RNPs). Deze methode mag efficiënte knock-out van de TGFBR2 en HPRT1 genen in NK-cellen. RT-PCR gegevens toonden een significante afname in gen expressie niveau, en een bepaling van de cytotoxiciteit van een representatieve cel product gesuggereerd dat de RNP gemodificeerde NK-cellen werd minder gevoelig voor TGFβ. Genetisch gemodificeerde cellen zou uitgebreide post-electroporation door stimulatie bestraalde mbIL21-tot uitdrukking te brengen feeder cellen.
Introduction
Kanker immunotherapie heeft in de afgelopen jaren naar voren geschoven. Genetisch gemodificeerde chimeer antigeen receptor (auto) T-cellen zijn een uitstekend voorbeeld van gemanipuleerde immuuncellen geïmplementeerd in kanker immunotherapie. Deze cellen zijn onlangs goedgekeurd door de FDA voor behandeling tegen CD19 + B cel maligniteiten, maar succes tot nu toe beperkt gebleven tot ziekten dragen van een paar targetable antigenen en richten van dergelijke beperkte antigene repertoires is gevoelig voor storing door immuun ontsnappen. AUTO T cellen hebben bovendien gericht geweest op het gebruik van autologe T cellen vanwege het risico van graft – versus – host-ziekte veroorzaakt door allogene T-cellen. In tegenstelling, NK-cellen zijn in staat om te doden van tumor doelen op een antigeen-onafhankelijke manier en niet leidt tot GVGH, waardoor ze een goede kandidaat voor kanker immunotherapie6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 technologie heeft onlangs zijn gebruikt in engineering immune cellen is, maar genetisch herprogrammering NK-cellen met plasmiden altijd uitdagend. Dit is vanwege problemen in de transgenic levering in een DNA-afhankelijke manier zoals lentivirale en retrovirale transductie veroorzaakt aanzienlijke procedure-geassocieerde NK cellen apoptosis en de beperkte productie van genetisch gemanipuleerde NK cellen4 , 9.
Vele ingeboren immune cellen express hoge niveaus van receptoren voor pathogen-geassocieerde moleculaire patronen zoals Retinoic acid-afleidbare gene ik (RIG-ik), waardoor verhoogde erkenning van buitenlandse DNA. Onderdrukking van deze trajecten heeft hogere efficiëntie van de signaaltransductie in NK-cellen, bij het gebruik van DNA gebaseerde methoden voor genetische modificatie10.
Hier beschrijven we de methode voor het gebruik van een DNA-vrije genoom bewerken van primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 ribonucleoprotein complexen (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs bestaat uit drie onderdelen, recombinant Cas9 eiwit complexvorm met synthetische single-gids RNA bestaat uit een complexvorm crRNA en tracerRNA. Deze Cas9/RNPs zijn geschikt voor het splijten van genomic doelen met hogere efficiëntie ten opzichte van buitenlandse DNA-afhankelijke benaderingen toe te schrijven aan hun levering als functionele complexen. Daarnaast, snelle goedkeuring van de Cas9/RNPs van de cellen kan het verminderen van de gevolgen van de af-target zoals inductie van apoptosis. Dus kunnen ze worden gebruikt voor het genereren van knock-outs of knock-ins wanneer gecombineerd met DNA voor homologe recombinatie6,7. We toonden dat electroporation van Cas9/RNPs is een makkelijk en relatief efficiënte methode die de eerdere beperkingen van genetische modificatie in NK-cellen overwint.
TGFβ is een grote immunosuppressieve cytokine, die de activering en de functies van NK-cellen remt. Er is gesuggereerd dat het gericht op de TGFβ-pathway immuun cel functies kan verhogen. We gericht de regio codering TGBR2 ectodomain die TGFβ11. bindt De representatieve resultaten tonen een significante afname in het niveau van mRNA uitdrukking van dit gen en verder aantonen dat het gewijzigde NK-cellen resistent voor TGFβ geworden. Bovendien, behouden de gewijzigde cellen levensvatbaarheid en proliferatieve potentieel, zoals ze zijn in staat om uitgebreide post-electroporation bestraalde feeder cuvetten. Daarom de volgende methode is een veelbelovende aanpak om genetisch te manipuleren NK-cellen voor een verdere klinische of onderzoek doeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-afhankelijke wijziging van NK-cellen heeft zijn uitdagend4,9. Wij dientengevolge, rechtstreeks een synthetisch voorgevormde ribonucleoprotein (RNPs) complex en Cas9 eiwit als gezuiverde eiwit in primaire en uitgebreide NK cellen8. Deze methode konden we elimineren aftopping, staart, en andere transcriptionele en translationele processen gestart door RNA polymerase II, die NK cellen apoptosis gekoppeld aan DNA-afhankelijke transductie m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Brian Tullius voor zijn vriendelijke hulp bij het bewerken van het manuscript.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
Riferimenti
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Ricerca sul cancro. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
