Cas9 Ribonucleoproteins का उपयोग करके नॉक-आउट प्राथमिक और विस्तारित मानव NK कोशिकाओं का निर्माण
Summary
यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्राथमिक या विस्तारित मानव प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं का उपयोग Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम मानव NK वृद्धि कारक-बी रिसेप्टर 2 (TGFBR2) और hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) को बदलने के लिए कमी कोशिकाओं उत्पन्न.
Abstract
CRISPR/Cas9 टेक्नोलॉजी कई सेल प्रकारों में जीनोम इंजीनियरिंग को तेज कर रही है, लेकिन अभी तक, जीन डिलिवरी और स्थिर जीन संशोधन प्राथमिक NK कोशिकाओं में चुनौतीपूर्ण रहा है । उदाहरण के लिए, lentiviral या retroviral transduction का उपयोग करते हुए transgene डिलीवरी पर्याप्त प्रक्रिया-संबद्ध NK सेल NK के कारण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर apoptosis कक्षों की एक सीमित उपज में हुई । हम यहां मानव प्राथमिक और विस्तारित NK Cas9 ribonucleoprotein परिसरों (Cas9/RNPs) का उपयोग कर कोशिकाओं के जीनोम संपादन के लिए एक डीएनए मुक्त विधि का वर्णन । इस विधि NK कोशिकाओं में TGFBR2 और HPRT1 जीन के कुशल नॉकआउट की अनुमति दी । RT-पीसीआर डेटा जीन अभिव्यक्ति के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी से पता चला है, और एक प्रतिनिधि सेल उत्पाद की एक cytotoxicity परख का सुझाव दिया है कि RNP संशोधित NK कोशिकाओं TGFβ के लिए कम संवेदनशील बन गया । आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं विकिरणित mbIL21-एक्सप्रेस फीडर कोशिकाओं के साथ उत्तेजना द्वारा पोस्ट-electroporation विस्तार किया जा सकता है ।
Introduction
कैंसर immunotherapy हाल के वर्षों में उन्नत किया गया है । आनुवंशिक रूप से संशोधित chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी कोशिकाओं को सफलतापूर्वक कैंसर immunotherapy में तैनात इंजीनियर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट उदाहरण हैं । इन कोशिकाओं को हाल ही में CD19 के खिलाफ उपचार के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया + बी सेल द्रोह, लेकिन सफलता अभी तक कुछ लक्षित एंटीजन असर रोगों तक ही सीमित किया गया है, और इस तरह के सीमित प्रतिजनी प्रदर्शनों को लक्षित कर रहे है प्रतिरक्षा से बचने की विफलता के लिए प्रवण है । इसके अलावा, कार टी कोशिकाओं क्योंकि भ्रष्टाचार के जोखिम की ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया गया है बनाम मेजबान allogeneic टी कोशिकाओं की वजह से रोग । इसके विपरीत, NK कोशिकाओं को एक प्रतिजन-स्वतंत्र तरीके से ट्यूमर लक्ष्यों को मारने में सक्षम है और GvHD कारण नहीं है, जो उंहें कैंसर immunotherapy6,7,8,9के लिए एक अच्छा उंमीदवार बनाता है ।
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी इंजीनियरिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं में हाल ही में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन आनुवंशिक रूप से plasmids के साथ NK कोशिकाओं reprogramming हमेशा चुनौतीपूर्ण रहा है । यह एक डीएनए निर्भर तरीके में transgene प्रसव में कठिनाइयों के कारण किया गया है जैसे lentiviral और retroviral पर्याप्त प्रक्रिया के कारण transduction-संबद्ध NK सेल apoptosis और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर NK कोशिकाओं के सीमित उत्पादन4 , 9.
कई जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं रोगज़नक़ के लिए रिसेप्टर्स के उच्च स्तर एक्सप्रेस ऐसे Retinoic एसिड के रूप में आणविक पैटर्न -inducible जीन मैं (रिग-मैं), जो विदेशी डीएनए की बढ़ मांयता सक्षम करें । इन रास्ते के दमन NK कोशिकाओं में उच्च transduction क्षमता सक्षम है जब आनुवंशिक संशोधन10के लिए डीएनए आधारित तरीकों का उपयोग कर ।
हम यहां का वर्णन एक डीएनए मुक्त जीनोम संपादन का उपयोग करने के लिए विधि प्राथमिक और विस्तारित मानव NK Cas9 ribonucleoprotein परिसरों का उपयोग कोशिकाओं (Cas9/RNPs) । Cas9/RNPs तीन घटकों से बना है, रिकॉमबिनेंट Cas9 प्रोटीन एक जटिल crRNA और tracerRNA के शामिल सिंथेटिक एकल गाइड आरएनए के साथ जटिल । ये Cas9/RNPs कार्यात्मक परिसरों के रूप में उनकी सुपुर्दगी के कारण विदेशी डीएनए-निर्भर दृष्टिकोणों की तुलना में उच्च दक्षता के साथ जीनोमिक लक्ष्यों को सट करने में सक्षम हैं । साथ ही, Cas9/RNPs की कोशिकाओं से तीव्र निकासी apoptosis की प्रेरण जैसे बंद लक्ष्य प्रभाव को कम कर सकते हैं । इस प्रकार, वे दस्तक-बहिष्कार उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या दस्तक-ins जब मुताबिक़ पुनर्संयोजन6,7के लिए डीएनए के साथ संयुक्त । हमें पता चला कि Cas9/RNPs के electroporation एक आसान और अपेक्षाकृत कुशल तरीका है कि NK कोशिकाओं में आनुवंशिक संशोधन की पिछले बाधाओं पर काबू पाना है ।
TGFβ एक प्रमुख immunosuppressive cytokine है, जो NK कोशिकाओं के सक्रियण और कार्यों को बाधित करता है । यह सुझाव दिया गया है कि TGFβ मार्ग लक्ष्यीकरण प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों को बढ़ा सकते हैं । हम TGBR2 ectodomain जो11TGFβ बांध क्षेत्र एंकोडिंग लक्षित। प्रतिनिधि परिणाम इस जीन के mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाने के लिए और आगे प्रदर्शित करता है कि संशोधित NK कोशिकाओं TGFβ के लिए प्रतिरोधी हो । इसके अतिरिक्त, संशोधित कक्ष व्यवहार्यता और प्रफलन क्षमता बनाए रखते हैं, क्योंकि वे विकिरणित फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके पोस्ट-electroporation का विस्तार करने में सक्षम होते हैं। इसलिए, निम्न विधि किसी भी आगे नैदानिक या अनुसंधान प्रयोजनों के लिए NK कोशिकाओं के लिए आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
NK कोशिकाओं के डीएनए पर निर्भर संशोधन4,9को चुनौती दी गई है । हम, इसलिए, सीधे एक कृत्रिम रूप से पेश ribonucleoprotein (RNPs) जटिल और प्राथमिक और विस्तारित NK कोशिकाओं8में शुद्ध प्रोटीन के रूप ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि संपादन में अपनी तरह की मदद के लिए ब्रायन Tullius स्वीकार करते हैं ।
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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