Her presenterer vi en detaljert protokoll for effektivt å gjøre homo- og heterografts mellom vannmelon og flasken gourd, i tillegg til metodene i vev prøvetaking data generasjon og dataanalyse for etterforskningen av kalde svarer microRNAs.
MicroRNAs (miRNAs) er endogene små ikke-koding RNAs på ca 20-24 nt, kjent for å spille viktige roller i anlegget utvikling og tilpasning. Det er en samler bevis viser at av visse miRNAs endres når pode, en landbruk praksis vanligvis anvendt av gårdbruker for å forbedre avling toleranse biotiske og abiotiske påkjenninger. Flaske gourd er en iboende klima-elastiske avling sammenlignet med mange andre store cucurbits, inkludert vannmelon, gjengi det en av de mest brukte grunnstammer sistnevnte. Siste fremme av høy gjennomstrømming sekvensering teknologi har gitt gode muligheter til å undersøke kalde svarer miRNAs og deres bidrag til heterograft fordeler; Likevel er tilstrekkelig eksperimentelle prosedyrer en forutsetning for dette formålet. Her presenterer vi en detaljert protokoll for effektivt generere homo- og heterografts mellom kalde-følsomme vannmelon og kalde-tolerant flasken gourd, i tillegg til vev prøvetaking, data generasjon og dataanalyse. Presentert metodene er også nyttig for andre plante-pode systemer, avhøre miRNA retningslinjer under ulike miljømessige påkjenninger, som varme, tørke og saltholdighet.
Pode har lenge vært ansatt som en landbruket teknikk å forbedre planteproduksjon og toleranse biotiske og abiotiske understreker1,2,3. I heterografting systemer, kan elite grunnstammer forbedre vann og næringsstoffer opptak av planter, styrke motstanden mot jord patogener og begrense de negative effektene av metall toksisitet4,5, som kan gi graftene en forbedret vekst kraft og økt toleranse mot miljømessige belastninger. I mange tilfeller kan heterografting også påvirke frukt kvaliteter i hagebruk planter, fører til økt frukt smaken og økt innhold helsemessige forbindelser6,7. Det har blitt funnet at langdistanse overføring av phyto-hormoner, RNAs, peptider og proteiner mellom rootstock og scion er en fundamental mekanisme modulerende vekst og utvikling omprogrammering scion planter8,9 ,10. Pode har vært mye brukt i studier av langdistanse signalering og transport i forhold til miljømessige tilpasning11. Pode eksperimenter er spesielt kraftig entydig deteksjon av overførte molekyler motta vev eller vaskulær sap, og aktivisering eller undertrykkelse av molekylære mål på grunn av signalet overføring12.
Non-koding RNAs, en stor klasse av at viktige forskrifter funksjoner i cellene, har blitt rapportert å spille en rolle i tilrettelegge anlegget tilpasning til abiotiske stress13. miRNAs er endogene små ikke-koding RNAs på ca 20-24 nt. undersøkelser avdekket regulatoriske rollen som miRNAs i forskjellige aspekter av anlegget aktiviteter, slik som skyte vekst, lateral rot formasjon14,15,16: nærings-opptak, sulfate metabolisme og homeostase17og Svar å biotiske og abiotiske stress18. Nylig uttrykk for miRNAs og sine mål gener var knyttet til salt stress toleranse i heterografted agurk seedlings19. I intervariety graftene av drue, ble svarene på miRNA uttrykk til tørke stress funnet for å være genotype-avhengige20.
Den raske utviklingen og redusere kostnadene for høy gjennomstrømming sekvensering teknologi har gitt en stor mulighet for studiet av miRNA forskrifter agronomical planter. Vannmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en viktig cucurbit avling dyrkes over hele verden, er utsatt for lave temperaturer. Flasken gourd (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) er en mer klima-elastiske cucurbit brukt av bønder pode med vannmelon. Hovedmålet med denne studien er å etablere en standard, effektiv og praktisk metode for å gjøre heterografts mellom vannmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) og flasken gourd (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Denne protokollen gir også en detaljert eksperimentelle ordningen og analytisk prosedyrer for studiet av regulering av miRNA uttrykk etter pode, noe som er nyttig for å avsløre mekanismene bak heterografting fordeler.
Anlegget materialene som brukes i denne studien omfatter vannmelon sorten og flaske gourd landrace. Vannmelon kultivaren er en kommersiell kultivar med høy avkastning men utsatt for lave temperaturer. Flaske gourd landrace er en populær rootstock for pode med vannmelon og agurk flasken gourd, på grunn av sin utmerkede toleranse for lave temperaturer21.
I denne protokollen beskrevet vi i detalj en svært effektiv og reproduserbar metode homo – og heterografts mellom vannmelon og flaske gourd. Denne metoden krever ingen bestemt utstyr, er svært enkel å betjene og vanligvis har en meget høy overlevelse av pode. Metoden kan også brukes til å lage grafts for andre cucurbits, som mellom vannmelon, agurk og gresskar.
Det er verdt å merke seg at den relative størrelsen (alder) rootstock og scion er kritisk til å gjøre en vellykket pode (tri…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (31772191), prosjektet for offentlig interesse i Zhejiang-provinsen (2017C 32027), nøkkel vitenskap prosjekt av anlegget oppdrett i Zhejiang (2016C 02051) og nasjonale programmet for Støtte fra topp unge fagfolk (til P.X.).
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |