Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att effektivt göra homo- och heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass, utöver metoder för vävnad provtagning, data generation och dataanalys, för utredning av kalla-lyhörd mikroRNA.
MikroRNA (Mirna) är endogena liten icke-kodande RNAs av omkring 20-24 nt, känd för att spela viktiga roller i växten utveckling och anpassning. Det finns en ackumulerande bevis visar att uttrycken för vissa MicroRNA ändras när ympning, en jordbrukspraxis som vanligen används av jordbrukare för att förbättra gröda tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar. Flaska kalebass är en inneboende klimattålig gröda jämfört med många andra stora gurkväxter, inklusive vattenmelon, gör den en av de mest använda grundstammar för den senare. Senaste befordran av hög genomströmning sekvensering teknik har gett stora möjligheter att undersöka kallt-lyhörd MicroRNA och deras bidrag till heterograft fördelar; men är tillräckliga experimentella rutiner en förutsättning för detta ändamål. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att effektivt generera homo- och heterografts mellan kall-mottagliga vattenmelon och kalla-tolerant flaskan kalebass, utöver metoder för vävnad provtagning, data generation och dataanalys. Metoderna som presenteras är också användbara för andra växt-ympning system, att förhöra miRNA föreskrifter enligt olika miljöpåfrestningar, såsom värme, torka och salthalt.
Ympning har länge använts som en jordbruks teknik att förbättra vegetabilieproduktion och tolerans mot biotiska och abiotiska betonar1,2,3. I heterografting system, kan elite grundstammar förbättra vatten och näringsämnen upptag av växter, stärka motstånd till jord patogener och begränsa de negativa effekterna av metal toxicitet4,5, som kan ge grafterna en förbättrad tillväxt vigor och ökad tolerans mot miljöpåfrestningar. I många fall kan heterografting också påverka frukt kvaliteter i trädgårds-växter, vilket leder till förbättrad fruktsmak och ökat innehåll av hälsorelaterade föreningar6,7. Det har konstaterats att långväga överföring av fytohormoner, RNAs, peptider och proteiner mellan grundstammen och scion är en grundläggande mekanism modulerande tillväxt och utveckling omprogrammering av scion växter8,9 ,10. Ympning har använts i studier av långdistans signalering och transporter i förhållande till miljöanpassning11. Ympning experiment är särskilt kraftfull för entydig identifiering av överförda molekyler i mottagande vävnad eller vaskulär sap, och aktiveringen eller undertryckande av molekylära mål på grund av signal transmission12.
Icke-kodande RNAs, en stor klass av RNA som utöva viktiga reglerande funktioner i celler, har rapporterats att spela en roll i att underlätta växt anpassning till abiotisk stress13. MicroRNA är endogena liten icke-kodande RNAs av omkring 20-24 nt. studier har visat reglerande roll av MicroRNA i olika aspekter av anläggningen aktiviteter, sådan som skjuter tillväxt, lateral rot bildandet14,15,16, näringsupptag, sulfat metabolism och homeostas17och Svaren till biotiska och abiotiska betona18. Nyligen, uttryck för MicroRNA och deras målgener var relaterade till salt stresstålighet i heterografted gurka plantor19. I intervariety grafterna av druvmust befanns svaren från miRNA uttryck till torkstress vara genotyp beroende20.
Den snabba utvecklingen och minskar kostnaden för hög genomströmning sekvenseringsteknologi har gett en stor möjlighet för studier av miRNA förordningar i agronomiska växter. Vattenmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en viktig cucurbit gröda som odlas över hela världen, är mottagliga för låga temperaturer. Flaska kalebass (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) är ett mer klimattåligt cucurbit som ofta används av jordbrukare för att ympa med vattenmelon. Det primära målet för den aktuella studien är att fastställa en standard, effektiv och bekväm metod för att göra heterografts mellan vattenmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) och flaskan kalebass (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Detta protokoll ger också en detaljerad experimentella system och analytiska förfaranden för studiet av regleringen av miRNA uttryck efter ympning, vilket är användbart för att avslöja de mekanismerna bakom heterografting fördelar.
De växtmaterial som används i denna studie inkluderar vattenmelon sorten och flaskan kalebass lantras. Vattenmelon sorten är en kommersiell sort med hög kapacitet men mottagliga för låga temperaturer. Flaska kalebass lantras är en populär grundstamssticklingar för ympning med vattenmelon, gurka och flaska kalebass, på grund av dess utmärkta tolerans av låga temperaturer21.
Detta protokoll beskriver vi i detalj en högeffektiv och reproducerbar metod för att göra homo- och heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass. Denna metod, som kräver ingen särskild utrustning, är mycket lätt att använda och har vanligtvis en mycket hög överlevnad av ympning. Metoden kan också användas för att göra grafts för andra gurkväxter, som mellan vattenmelon, gurka och pumpa.
Det är värt att notera att den relativa storleken (år) av rotstock och scion är a…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31772191), forskningsprojektet för allmänintresset i Zhejiang-provinsen (2017C 32027), det nyckel vetenskap projekt av växtförädling i Zhejiang (2016C 02051) och det nationella programmet för Stöd av Top-notch unga yrkesverksamma (till P.X.).
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |