Questo protocollo presenta un metodo per valutare l'attività proteolitica di una proteasi fatturato intrinsecamente bassa attività, unico in un contesto cellulare. In particolare, questo metodo viene applicato per valutare l'attività proteolitica di PCSK9, un driver chiave del metabolismo lipidico cui attività proteolitica è richiesto per la sua funzione ipercolesterolemici ultimate.
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Articolo metodologico
Un'analisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteina convertasi subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) è una proteasi di singolo-fatturato che regola i livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL) del siero e, di conseguenza, la malattia cardiovascolare. Anche se PCSK9 proteolisi sono richiesto per il suo effetto completo ipercolesterolemico, la valutazione della sua funzione proteolitica è impegnativa: PCSK9 è noto solo per fendere se stesso, subisce solo un singolo fatturato e dopo proteolisi, conserva il suo substrato in suo sito attivo come inibitore di auto. I metodi presentati qui descrivono un'analisi che supera queste sfide. L'analisi si concentra sulla proteolisi intermolecolari in un contesto di basati su cellule e avvenuta scissione collegamenti per l'attività luciferasica secrete, che possono essere facilmente lette nel medium condizionato. Via passaggi sequenziali di mutagenesi, trasfezione transiente e una lettura di luciferasi, il dosaggio può sondare PCSK9 proteolisi in condizioni di perturbazione o genetici o molecolari in un modo ad alta velocità. Questo sistema è adatto per entrambi la valutazione biochimica di missenso clinicamente scoperto polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), anche per quanto riguarda lo screening di piccole molecole inibitori di PCSK9 proteolisi.
Introduzione
PCSK9 è destinato il ricevitore di LDL (LDL-R) per la degradazione, innalzamento del colesterolo LDL (LDL-C) e guida la malattia cardiaca aterosclerotica1,2. Therapeutics targeting PCSK9 robusto abbassare LDL-C e per migliorare i risultati cardiovascolari per i pazienti, anche quando aggiunto ad una terapia ipolipemizzante aggressiva con le statine3,4. Tuttavia, terapie attualmente approvate sono limitate ad approcci basati su anticorpi e soffrono di una mancanza di redditività5,6. Per risolver....
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Protocollo
1. mutagenesi di proteasi vettoriale
- Progettare e ordinare oligonucleotidi sintetizzati personalizzato per installare una mutazione di interesse usando una modifica di protocolli di mutagenesi sito-diretta standard12. Primer standard dissalate (senza ulteriore purificazione) sono perfettamente accettabili.
Nota: Un approccio generale ai disegni di primer comporta la creazione di primer parzialmente sovrapposti come indicato nella tabella 1, utilizzando una calcolatrice fusione di temperatura (Tm) specifica per la polimerasi di interesse. - Impostare le reazioni a catena della polimerasi (PCR) per....
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Risultati
Il saggio di proteolisi di alto-rendimento si basa su superare tre grandi sfide. In primo luogo, per superare l'uscita intrinsecamente bassa di una proteasi PCSK9 singolo-fatturato, una proteasi di PCSK9 manca l'inibitoria propeptide è utilizzato, con la sequenza di clivaggio Tail il propeptide collegata a una luciferasi che possono essere secrete14. In secondo luogo, per soddisfare la necessità per la proteasi piegare complesso con suoi inibitori propeptide, che d.......
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Discussione
Le procedure sperimentali descritte sopra presentano un metodo per superare l'attività intrinsecamente bassa della singolo-fatturato proteasi PCSK9 e valutare la sua funzione proteolitica in modo robusto. Il concetto chiave del dosaggio si basa sulla conversione di un evento singolo-fatturato in una lettura enzimaticamente amplificata. I punti di forza del test includono la relativamente breve periodo di tempo e facilità d'uso del reporter di luciferase, come pure la sua scalabilità agli approcci di alto-rendimento. Inol.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il generoso sostegno finanziario dal NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH attraverso la UCSF clinica e traslazionale Science Institute catalizzatore Program (UL1 TR000004), il Senato accademico di UCSF, la Fondazione di Hellman, una Gilead Sciences Research Scholar Award, un premio di cardiovascolare Pfizer ASPIRE (tutte John S. Chorba) e l'Howard Hughes Medical Institute (a Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per PCR | USA Scientific | 1402-2900 | per PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | di soluzioni di DNA polimerasi |
| deossinucleotidica | New England Biolabs | N0447L | dNTP (per PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Autori | n/a | Disponibile dagli autori |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Autori | n/a | Disponibile dagli autori |
| Agarosio LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | Per gel DNA Sistema |
| E-Gel Imager con base a luce blu | ThermoFisher Scientific | 4466612 Per l'imaging | gel DNA |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Per gel DNA |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | Per tampone di corsa in gel di DNA |
| Acido acetico glaciale | ThermoFisher Scientific | A38-500 | Per tampone di corsa in gel di DNA |
| Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, per tampone di corsa in gel di DNA |
| 1 kb Scala di DNA | Gold Biotechnology | D010 | Scala di DNA |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Enzima di restrizione |
| Piastre LB Agar con 100 µ g/mL carbenicillina | Teknova | L1010 | LB-Carb piastre |
| One Shot Mach1 T Resistente ai fagi Chimicamente competente E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Cellule chimicamente competenti |
| LB Brodo, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillina | Gold Biotechnology | C-103-5 | Antibiotico |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | Kit Miniprep per la purificazione del DNA |
| Spettrofotomero NanoDrop 2000 Spettrofotometro | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spettrofotometro |
| 293T Cells American Tissue | Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, glucosio alto, piruvato | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, cellula di mammifero Sieri |
| fetali bovini | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Tripsina, per dissociazione cellulare |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Contatore automatico di cellule Countess | ThermoFisher Scientific | C10227 | Conteggio automatico delle cellule |
| Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess | ThermoFisher Scientific | C10228 | Vetrini per conteggio cellulare |
| Piastre per coltura tissutale CELLSTAR, bianche, a fondo bianco, con coperchio | Grenier Bio-One | 655083 | Piastra a 96 pozzetti bianca a fondo bianco |
| TempPlate piastra per PCR a 96 pozzetti senza bordatura, naturale | USA Scientific | 1402-9596 | Piastra a 96 pozzetti per piastra plasmidico master |
| Nunc 2.0mL DeepWell Piastre | ThermoFisher Scientific | 278743 | Piastra a 96 pozzetti |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific L3000008 | Reagente per trasfezione lipidica, Reagente Lf3K | |
| P3000 Reagente | pre-complessazione del DNA | ThermoFisher Scientific | L3000008 |
| OptiMEM I | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Terreno sierologico ridotto per trasfezione |
| (+)-L-ascorbato di sodio | Millipore Sigma | A4034 | Ascorbato di sodio |
| Cloruro di sodio | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumina, siero bovino, frazione V, metalli pesanti bassi | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Metanolo (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Acido cloridrico | VWR | JT9535-2 | Concentrato HCl |
| Celeterazina | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Substrato di luciferasi |
| Filtro per siringa, sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Filtro sterile, PVDF, 0,22 e micro; |
| Pipetta multifunzione Pipet-Lite L12-200XLS+ | Pipetta | multicanale | Rainin 17013810 |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Pipetta | multicanale | Rainin 17013808 |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Pipetta multicanale | Rainin 17013807 | |
| Serbatoio reagente | Corning | 4870 | Trogolo per reagenti |
| Provette da centrifuga, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | Provette da 15 mL |
| Provette da centrifuga, 50 mL | Corning | 430829 | Provette da 50 mL |
| Spark Lettore di micropiastre Tecan | N/A | Plate Reader | |
| Excel | Microsoft 2016 per Mac | Software per fogli di calcolo | |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Software per l'analisi dei dati scientifici |
Riferimenti
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
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Ristampe e permessi
