إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية
Summary
وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام الموجودة مسبقاً بنيات الحذف كاسيت مقاومة المضادات الحيوية كأساس لتحقيق طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة هذه الطفرات الحذف وإدراجها في محور المقابلة من سلالة المستلم باستخدام توصيل عاثية P1.
Abstract
نهج أول دراسة مهمة الجينات غير معروف في البكتيريا خلق المغلوب هذا الجين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول قوية وسريعة لنقل طفرات الجينات الحذف من سلالة الإشريكيّة القولونية واحد إلى آخر باستخدام توصيل المعمم مع عاثية P1. يتطلب هذا الأسلوب أن الطفرة تكون انتقائية (مثلاً، استناداً إلى اضطرابات الجينات باستخدام غرز كاسيت المضادات الحيوية). مثل هذه الأشرطة المضادات الحيوية يمكن تعبئتها من سلالة مانحة وأدخلت سلالة المستفيدة من تهم بسرعة وتوليد متحولة حذف جينات بسهولة. يمكن تصميم كاسيت المضادات الحيوية تشمل فلبس التعرف على المواقع التي تسمح بختان الإناث الكاسيت ريكومبيناسي الخاصة بالموقع لإنتاج المغلوب نظيفة مع تسلسل ندبة ~ 100-قاعدة-زوج-منذ فترة طويلة في الجينوم. إظهار البروتوكول بانقطاع الجين تاما الترميز عاملاً الجمعية المعنية في نشوء حيوي أوتوترانسبورتير، واختبار تأثير هذا المغلوب على نشوء حيوي ووظيفة هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس. على الرغم من حذف الجينات بتوصيل P1 قصوره، بسهولة وسرعة تنفيذه جعلها بديلاً جذاباً لأساليب أخرى لحذف الجينات.
Introduction
نهج أول مشترك لدراسة وظيفة الجين هو أداء الطفرات المغلوب ومراعاة النمط الظاهري الناتج عن ذلك. وهذا يسمى أيضا علم الوراثة العكسي. بكتيريا كولاي كانت العمود الفقري للبيولوجيا الجزيئية للسنوات السبعين الأخيرة، أو حتى، بسبب السهولة في استزراع وبه الانقياد للتلاعب بالجينات1. وقد وضعت عدة أساليب لإنتاج الجينات الحذف في كولاي، بما في ذلك علامة تبادل الطفرات2،3 ، وفي الآونة الأخيرة، ريكومبينيرينج باستخدام λ الأحمر أو ET راك نظم4،5 , 6.
في نظام مستخدمة على نطاق واسع، وتحل محلها متواليات ترميز الجينات الفردية كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية التي يمكن فيما بعد أن اقتطعت من5،كروموسوم7. يتم استبدال تسلسل الترميز، على سبيل المثال بكاسيت مقاومة كاناميسين (أساسه)، الذي يحيط به فلبس (حزب العمل الفيجي) الاعتراف بالمواقع المستهدفة (معاهدة سجل الأفلام) على كلا جانبي. يتم التعرف على مواقع FRT قبل recombinase حزب العمل الفيجي، الذي يتوسط جزئ خاصة بالموقع بين المواقع FRT مما يؤدي إلى حذف الكاسيت كان. وبهذه الطريقة، يمكن تحقيق حذف كامل لتسلسل الجين المعطى للترميز، تاركين وراءهم تسلسل ندبة الحد أدنى فقط من حوالي 100 قاعدة أزواج (bp) (الشكل 1).
فقط على مدى عقد من الزمان، وقد وضعت ما يسمى مجموعة كيو. هذه هي مكتبة بكتيرية استناداً إلى أحد مختبرات قياسية السلالة K12 كولاي ، حيث تم حذفها تقريبا جميع الجينات غير الضرورية على حدة بواسطة λ جزئ الأحمر7،8. وقد استنساخ ضمن هذه المجموعة كل تسلسل ترميز واحد استبداله كاسيت مقاومة كان المهربة. جمع كيو ثبت أن تكون أداة مفيدة للعديد من التطبيقات9. واحد مثل هذا الطلب هو إنتاج طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة الكاسيت كان من استنساخ حذف معين قبل عموما ترانسدوسينج باكتيريوفاجيس، مثل P110،،من1112،،من1314. ثم يمكن استخدام أسهم بالعاثية أعدت من سلالة من هذا القبيل لتصيب مستلم سلالة كولاي من الفائدة، حيث تردد منخفض ولكن موثوق بها كان المنطقة المحتوية على كاسيت يمكن إدراجها في جينوم المتلقي من جزئ مثلى (الشكل 2). يمكن تحديد ترانسدوكتانتس للنمو عن طريق الوسائط التي تحتوي على أساسه. وفي أعقاب ذلك، إذا كان المطلوب هو إزالة كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية، يمكن توفيره recombinase حزب العمل الفيجي إلى سلالة ترانسدوكتانت في ترانس. بعد علاج بلازميد المحتوية على حزب العمل الفيجي، الذي يحمل علامة مقاومة الأمبيسلّين (أمبير)، يتم فحص الحيوانات المستنسخة أساسه ومراعية لامبير ل، والختان الصحيح لتسلسل البرية من نوع الترميز وكاسيت كان يتم التحقق من قبل مستعمرة [بكر].
هنا، يقدم بروتوكول مفصلاً، تصف كل خطوة من الخطوات في إنتاج المغلوب سلالة كولاي استناداً إلى الاستراتيجية المبينة أعلاه. على سبيل مثال، يظهر حذف من الجينات تاما . بترميز تاما بروتين بيتا لبرميل غشاء خارجي الذي هو جزء من النقل والجمعية الوحدة النمطية (TAM)، الذي تشترك في نشوء حيوي لبعض البروتينات أوتوترانسبورتير وبيلي15،،من1617. ثم استخدم هذه السلالة المغلوب لدراسة تأثير الحذف تاما على نشوء حيوي هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس (TAAs) وأدهيسين واليرسينيا يادا كولاي الغلوبولين المناعي (Ig)-ملزمة “ﻷعمالهم عيبد” 18،19.
Protocol
Representative Results
Discussion
توصيل P1 طريقة سريعة وقوية وموثوق بها لتوليد الجينات الحذف في كولاي. وهذا يتجلى هنا ترانسدوسينج متحولة حذف تاما من سلالة مانحة كيو إلى مستلم المستمدة من BL21. المراحل الرئيسية في عملية توصيل يتم إنتاج ترانسدوسينج ليستي، توصيل نفسها، وختان كاسيت المقاومة أساسه، والتحقق من المغلوب ب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الحصول على سلالات مجموعة كيو من المشروع بيوريسورسي الوطني (رجال، اليابان): كولاي. ونحن نشكر “ديرك لينكه” (قسم العلوم البيولوجية، جامعة أوسلو) على دعمه المستمر. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث منحة النرويج الشباب الباحث 249793 (لجاك ليو جيم).
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
Riferimenti
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
