Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제
Summary
여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.
Abstract
박테리아에서 알 수 없는 유전자의 기능 연구에 대 한 첫 번째 접근은이 유전자의 녹아웃을 만드는 것입니다. 여기, 우리는 강력 하 고 빠른 살 균 소 P1 일반화 된 변환 사용 하 여 다른 한 대장균 긴장에서 유전자 삭제 돌연변이 전송 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 돌연변이 선택 가능 (예: 항생제 카세트 삽입을 사용 하 여 유전자 중단에 따라) 해야 합니다. 이러한 항생제 카세트 기증자 긴장에서 동원 될 수 있습니다 관심 받는 사람 부담으로 신속 하 게 도입 하 고 쉽게 유전자 삭제 돌연변이 생성. 항생제 카세트 사이트별 recombinase 게놈에서 순서 ~ 100-기지-쌍-긴 흉터만 깨끗 한 녹아웃을 생산 하 여 카세트의 절단을 허용 하는 flippase 인식 사이트를 포함 하도록 디자인할 수 있습니다. 우리는 어셈블리 요소 autotransporter 속에 관련 된 인코딩 타 유전자를 노크 하 여 프로토콜을 설명 하 고는 속에이 노크 아웃의 효과 및 2 개의 trimeric autotransporter adhesins의 기능 테스트. P1 변환에 의해 유전자 삭제는 한계가, 비록 편리 하 고 속도 구현 하기가 유전자 삭제의 다른 방법에 매력적인 대안.
Introduction
유전자의 기능 연구에 대 한 일반적인 첫 번째 접근 노크 아웃 mutagenesis 수행 결과 표현 형을 관찰 하는 것입니다. 이것은 또한 반전 유전학을 불린다. 지난 70 년 동안 또는 이렇게, 그것의 경작 및의 순종 유전자 조작1의 용이성으로 인해 박테리아 대장균 분자 생물학의 주력 하고있다. 여러 가지 방법은 대장균, 등 표식 exchange mutagenesis2,3 , 더 최근에, λ 레드 또는 Rac 외 시스템4,5 를 사용 하 여 recombineering에에서 유전자 삭제를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. , 6.
널리 사용 되는 시스템에서 개별 유전자의 코딩 시퀀스에서 염색체5,7excised 나중 수는 항생제 저항 카세트로 대체 됩니다. 코딩 시퀀스 대체 된다, 예를 들어 대 (칸) 저항 카세트, 양쪽에 flippase (FLP) 인식 대상 (FRT) 사이트에 의해 형벌 이다. FRT 사이트 recombinase 칸 카세트의 삭제로 이어지는 FRT 사이트 간의 사이트 재결합 중재 FLP에 의해 인식 됩니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자의 코딩 시퀀스의 전체 삭제 얻을 수 있습니다, 약 100의 기본적인 쌍 (bp) (그림 1)의 순서만 최소한의 흉터를 남겨두고.
전 10 년 넘게 소위 게이오 컬렉션 개발 되었다. 이것은 세균성 라이브러리 기반 표준 실험실 대장균 K12 변형, 거의 모든 비-필수 유전자 λ 빨간 재결합7,8에 의해 개별적으로 삭제 되었습니다. 이 컬렉션에서 클론 excisable 칸 저항 카세트 교체의 코딩 시퀀스 한 개 있다. 케이오 컬렉션9많은 응용 프로그램 대 한 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 하나는 같은 응용 프로그램 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이의 생산 이다. 일반적으로 살 균 소, P110,11,12,,1314등을 시험 하 여 주어진된 삭제 복제에서 칸 카세트를 동원 수 있습니다. 살 균 소 주식 같은 긴장에서 준비 사용할 수 있습니다 받는 사람의, E. 콜라이 긴장을 감염 하 어디 낮은 하지만 신뢰할 수 있는 주파수는 칸에서 카세트 포함 된 지역 포함 될 수 있습니다 받는 사람 게놈으로 동종 재결합에 의해 (그림 2)입니다. Transductants 칸 포함 된 매체에 성장에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 따라 항생제 저항 카세트의 제거를 원하는 경우 트랜스 transductant 변형에 FLP recombinase 공급 수 있다. FLP 포함 된 플라스 미드, 암 피 실린 (Amp) 저항 마커를 운반, 경화 후 칸와 앰프-민감한 클론에 대 한 검사는 하 고 야생-타입 코딩 순서와 칸 카세트의 정확한 절단 식민지 PCR에 의해 확인 됩니다.
여기, 상세한 프로토콜 제공 됩니다, 각 녹아웃 대장균 스트레인 위에서 설명한 전략에 따라 생산 단계를 설명 하. 예를 들어, 타 마 유전자의 삭제는 보여 줍니다. 타 마 일부 전송 및 어셈블리 모듈 (TAM), 특정 autotransporter 단백질 및 pili15,,1617의 속에 포함 되는 외부 막 β 배럴 단백질을 인코딩합니다. 이 노크 아웃 긴장은 다음 2 개의 trimeric autotransporter adhesins (다시), 페스트 adhesin YadA와 대장균 면역 글로불린 (Ig)는 속에 다 마 삭제의 효과 검사 하는 데 사용 됩니다-TAA EibD 바인딩 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
P1 변환 대장균에 유전자 삭제를 생성 하기 위한 빠르고, 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 여기 BL21 파생 된 받는 사람에 게 케이오 기증자 스트레인에서 타 마 삭제 돌연변이 시험에 의해 증명 됩니다. 변환 프로세스의 주요 단계는 lysate는 시험의 생산, 자체 변환, 칸 저항 카세트의 절단 및 PCR에 의해 녹아웃의 확인. 총에서 과정 약 1 주일 소요 하며 확인에 대 한 최종 PCR를 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
케이오 컬렉션 긴장 국가 유관 프로젝트 (검, 일본)에서 가져온: 대장균. 그의 지속적인 지원에 감사 더크 맺고 (생물 과학 부, 오슬로 대학교) 하 고. 이 작품은 노르웨이 젊은 연구원 부여 249793 (잭 C. 레오)의 연구 위원회에 의해 투자 되었다.
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
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