Summary
نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.
Abstract
نظم النسخ ثنائي أدوات قوية الوراثية المستخدمة على نطاق واسع لتصور، والتلاعب بالخلية التعبير مصير والجينات في مجموعات محددة من الخلايا أو الأنسجة في الكائنات نموذج. هذه النظم تحتوي على عنصرين هما كخطوط منفصلة وراثيا. سطر برنامج تشغيل يعرب منشط النسخي تحت السيطرة من الأنسجة على حدة المروجين/القدرة على، ومرافئ خط مراسل/المستجيب جين المستهدف وضع مجرى النهر إلى موقع ربط المنشط النسخ. حمل الحيوانات التي تأوي كل من مكونات ترانساكتيفيشن الخاصة بالانسجة لتعبير الجينات المستهدفة. دقة التعبير الزمانية المكانية للجينات في الأنسجة المستهدفة حاسمة بالنسبة لتفسير غير متحيز لنشاط الخلية/الجينات. ولذلك، وضع أسلوب لتوليد خطوط الحصرية الخاصة بخلية/الأنسجة سائق ضروري. هنا نقدم طريقة لإنشاء نظام التعبير العالية الخاصة بالانسجة المستهدفة باستخدام "متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار/كريسبر-المرتبطة" (كريسبر/Cas)-على أساس الجينوم تحرير الأسلوب. في هذا الأسلوب، دليل اندونوكليسي ويستهدف Cas9 اثنين تشيميريك الكشف (جرنة) إلى مواقع محددة في إكسون الترميز الأول للجينات في الجينوم المورفولوجية لإنشاء فواصل مزدوجة-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). فيما بعد، باستخدام بلازميد مانحة خارجية تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور، آلات إصلاح الخلية ذاتية تمكن الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من جهاز تسوية المنازعات، مما يؤدي إلى الحذف الدقيق واستبدال إكسون مع ترانساكتيفاتور التسلسل. وأعرب عن ترانساكتيفاتور طرقت في حصرا في الخلايا حيث رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية لاستبدال الجينات الوظيفية. البروتوكول خطوة بخطوة مفصلة تقدم هنا لتوليد سائق النسخي ثنائي المعرب عنها في صندوق الأجيال القادمة المورفولوجية/فروعها-إنتاج الخلايا الظهارية/العصبية يمكن اعتمادها لأي تعبير الجينات أو أنسجة محددة.
Introduction
الأدوات الجينية للجينات المستهدفة قد وضعت أيضا في المورفولوجية، يجعلها واحدة من أفضل أنظمة نموذجية للتحقيق في وظيفة الجينات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. نظم ثنائية التعبير، مثل الخميرة Gal4/UAS (التسلسل التنشيط المنبع)، اعتمد أولاً للأنسجة على حدة محسن ميسيكسبريشن الملائمة والجينات في نموذج الجينية المورفولوجية 1 (الشكل 1). هذا النظام على تيسير تطوير عدد كبير من تقنيات مثل تنظيم الزمانية المكانية overexpression الجينات، ميسيكسبريشن، وخروج المغلوب في مجموعات محددة من الخلايا، وكذلك كما هو الحال في خلية التذرية، ووسم الخلية، واقتفاء أثر مباشر الخلوية والجزيئية العمليات في الأجنة والأنسجة وتتبع النسب والتحليلات فسيفساء أثناء التطوير. عدد من النسخ ثنائي النظام، مثل البكتيريا ليزا نيوروسبورا س-نظام، ونظامليزاالبروتوكول الاختياري (الشكل 1) هي أدوات قوية الجينية التي تستخدم الآن على نطاق واسع في المورفولوجية، بالإضافة إلى نظام Gal4/UAS الأصلي للجينات المستهدفة التعبير1،،من23.
وهنا نقدم طريقة لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي التعبير باستخدام أسلوب التحرير الجينوم. التطورات الأخيرة في كريسبر/Cas9 الجينوم تكنولوجيا تحرير أتاحت فرصاً غير مسبوقة لإجراء تغييرات جينوم الموجهة في طائفة واسعة من الكائنات الحية. بالمقارنة مع التقنيات المتاحة الجينوم التحرير الأخرى، نظام كريسبر/Cas9 رخيصة وفعالة وموثوق بها. وتستخدم هذه التكنولوجيا مكونات الجهاز المناعي التكيفي البكتيرية: اندونوكليسي Cas9 العقدية المقيّحة يقوم بإنشاء فاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، ودليل تشيميريك رنا (جرنة)، التي توجه Cas9 لموقع معين جينوم ل جهاز تسوية المنازعات المستهدفة4. الخلايا تحتوي على إليه لإصلاح جهاز تسوية المنازعات باستخدام مسارات مختلفة. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) يؤدي إلى الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف لتعطيل وظيفة الجينات، وحين يدخل الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من معرفة الموجهة/مرغوب فيه الجينوم تدق-في/المغلوب باستخدام جهة مانحة خارجية في تقرير التنمية البشرية كقالب. كفاءة يمكن أن تستخدم استراتيجية استبدال المستندة إلى تقرير التنمية البشرية لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي تعبير، التي يمكن التغلب على جميع القيود المفروضة على أساليب فخ محسن التقليدية. يصف لنا إجراء خطوة بخطوة للاستفادة إصلاح HDR كريسبر/Cas9-تعتمد في توليد خط نسخ ثنائي برنامج تشغيل التي يتم التعبير عنها تحت سيطرة الذاتية تنظيم النسخي وبوستترانسكريبشونال المورفولوجية الجينات. في هذا البروتوكول، ونظهر توليد خط برنامج تشغيل محدد فروعها (bnl) الجينات ترميز بروتين أسرة صندوق الأجيال القادمة الذي ينظم morphogenesis المتفرعة من مجرى الهواء الرغامى ظهارة5. في هذا المثال، استعيض إكسون الترميز الأول من الجينات bnl تسلسل تسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية دون تغيير أي الذاتية رابطة الدول المستقلة-تسلسل الجين bnl التنظيمية. نظهر أن الاستراتيجية التي تم إنشاؤها بخط سائق bnl-ليزا سباتيوتيمبورالي يتحكم في التعبير عن الجينات مراسل وضعت المتلقين للمعلومات من ليكساوبيراتور (ليكساوب أو لكسو) حصرا في bnl- وإذ تعرب عن الخلايا الظهارية/الوسيطة/العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تصميم وتشييد جرنة "ناقلات التعبير"
- لتحل محل منطقة محددة بفترة طويلة من إكسون دقة، استخدم جرنة مزدوج نهج6، التي تستهدف كل جرنة يمكن على وجه التحديد طرفي المنطقة المحددة التي تهم. للحصول على تعبير الزمانية المكانية الخاصة بالجينات دقيقة من برنامج التشغيل، حدد اثنين من المواقع المستهدفة جرنة داخل إكسون الترميز الأول من الجينات.
-
melanogaster المورفولوجية، تحديد المواقع المستهدفة جرنة باستخدام أداة "الباحث عن الهدف الأمثل" فليكريسبر (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). يمكن استخدام أدوات التصميم كريسبر المتاحة الأخرى أيضا، بما في ذلك أداة "التصميم الأمثل كريسبر" (http://crispr.mit.edu)، FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9)، وهاء-هش (www.e-crisp.org/E-CRISP).
ملاحظة: اعتمد البروتوكولات التالية لتصميم جرنة والاستنساخ من الأساليب هو موضح سابقا6،7.- نسخ التسلسل الفعلي في المربع المتوفر في أداة على الإنترنت. حدد المورفولوجية المفرج عنهم في الآونة الأخيرة melanogaster الجينوم إصدار التعليق التوضيحي، "r_6"، في القائمة المنسدلة ل "حدد الجينوم." في "دليل تحديد طول الحقل (nt)،" إدخال "20". حدد للبحث عن "جميع الأهداف كريسبر" وانقر فوق "البحث عن أهداف كريسبر".
- تقييم كافة الأهداف جرنة المرشح بإعداد "الحد الأقصى" ل "التشدد" و "نج فقط" "بام". في محاولة لتحديد المواقع التي جرنة دون أي إيقاف-الأهداف المحتملة أو عدد أدنى من إيقاف الأهداف الممكنة. استخدام أداة الشبكة الموصوفة في دونك et al. عام 2014 8 إلى اختر جرناس بدرجة "جيد" نشاط محتملة.
- في نفس الوقت، ضمان أن هناك تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحدة لا في الأهداف جرنة في جينوم السطر يطير الأصل المحدد لحقن (مثلاً، غ-Cas9 على كروموسوم إكس، از # 54591). اتبع البروتوكول، المذكورة في et al. عام 2015 وغراتز7 لاستخراج الحمض النووي الجينومي من السطر يطير الأصل. [بكر] تضخيم، تقريبا، 500 – 1,000 nt المناطق باستخدام كبسولة تفجير أن الجناح تسلسل الفائدة وبوليميراز الدنا عالية الدقة؛ تسلسل--التحقق من منتجات PCR تضخيمه.
-
لتوليد ناقل تعبير جرنة جنبا إلى جنب، اتبع مستقلة عن عملية ربط استنساخ بروتوكول6 إدخال تسلسلين بروتوسباسير إلى ناقل تعبير رنا pCFD4. نلاحظ أن متجه تعبير محسنة متعددة-جرنة (pCFD5) متوفر الآن حيث يتم التعبير عن سجرناس كلا من المروجين U6:3 قوية9 (https://www.crisprflydesign.org). استخدام أسلوب "الجمعية الحمض النووي" لاستنساخ جرناس إلى ناقل pCFD4.
- تصميم وترتيب الإشعال إلى الأمام وعكس لإدخال تسلسلين بروتوسباسير pCFD4 ناقل التعبير الحمض النووي الريبي (الجدول 1 ألف). كما هو موضح سابقا6، يتضمن الدليل التمهيدي إلى الأمام التسلسل بروتوسباسير أول يحف به المناطق المقابلة لمروج U6-1 والأساسية جرنة في pCFD4؛ عكس التمهيدي يحتوي على تسلسل تكملة عكس بروتوسباسير الثاني الذي كان واقفاً إلى جانب المناطق المقابلة للب جرنة ومروج U6-3 في pCDF4.
- ريسوسبيند الإشعال إلى 100 ميكرومتر مع الدناز وخالية من رناسي مزدوجة الماء المقطر (ddH2س). جعل 10 ميكرومترات عامل تركيز تمهيدي. استخدام بلازميد pCFD4 كقالب وقم بإعداد رد بكر بوليميريز عالية الدقة استخدام والإعدادات ل تفاعل PCR6الموصى بها.
- لاستنساخ المنتج تضخيم في pCFD4، هضم بلازميد pCFD4 مع إنزيم بسي بإعداد رد فعل التالي: 2 – 5 ميكروغرام من بلازميد pCFD4، 5 ميكروليتر من 10 × العازلة الهضم، ميكروليتر 1 إنزيم بسي، و ddH2س إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 50 ميكروليتر. خلط محتويات الرد بالتنصت على الأنبوبة برفق وجمع جميع قطرات متناثرة من جدار الأنبوب إلى الأسفل التي تدور موجزة. احتضان ميكس رد فعل في 37 درجة مئوية ح 2.
- تشغيل المنتج بكر من الخطوة 2 والمنتج هضمها من الخطوة 3 على 1% [اغروس] هلام. إجراء التفريد لما يكفي من الوقت لفصل النطاقات الحمض النووي تماما. قص الصحيحة الحجم العصابات الحمض النووي تحت ترانس-إضاءة الأشعة فوق البنفسجية قبل تنقية المنتجات المتوقعة باستخدام هلام شطف العمود اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). وينبغي أن يكون المنتج بكر 600 شركة بريتيش بتروليوم، وبلازميد pCFD4 خطية ينبغي أن يكون ~6.4 كيلو بايت 6.
- قم بإعداد رد فعل الجمعية الحمض النووي في أنبوب بكر، كل تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
- تحويل 2 ميكروليتر من المنتج الجمعية المختصة البكتيريا (DH5α أو سلالات مماثلة مع ΔrecA1، ΔendA1)، ولوحة على الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على لوحات أجار ليبره (رطل/أمبير)، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لاحظ أن هذا المزيج الجمعية الحمض النووي قد تكون سامة لبعض سلالات البكتريا ولكن تمييع هذا المزيج الجمعية يمكن أن تقلل من السمية.
- اختيار المستعمرات الأمبيسلّين المقاوم 3 – 4 من لوحة المحتضنة بين عشية وضحاها، وتطعيم مستعمرة مل 3 رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، وتنمو البكتيريا الملقحين في شاكر 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. استخراج بلازميد من البكتيريا مثقف بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة مصغرة الإعدادية بلازميد اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
- التسلسل والبلازميدات مع T3 التمهيدي عالمي للشاشة لاستنساخ الصحيح الذي يحتوي على الإدراج جرنة جنبا إلى جنب. إنشاء مخزون والغليسيرول من البكتيريا التي حولت التحقق من التسلسل pCFD4-جرنة في الجلسرين 20% ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2-تصميم وتشييد الجهة المانحة HDR
-
للجينوم تدق من تسلسل Gal4 أو ليزا ، تصميم المانحين HDR مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل التي تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور الذي كان واقفاً إلى جانب اثنين من الأسلحة التماثل.
- استخدام > ترك 1.5 كيلو بايت والأسلحة التماثل الحق المرافقة استهداف جرنة (ق). الأسلحة التماثل الموسعة زيادة كفاءة تقرير التنمية البشرية أثناء عملية إصلاح 10.
- [بكر] تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي الجينوم (جدنا) المستخرجة من الأصل يطير الخط المحدد لحقن (مثلاً، غ-Cas9 (على كروموسوم X)، از # 54591). استخدام التجارب المطبعية ابدأ ساخنة بوليميراز دنا بوليميراز إنزيم مناسبة لفترة طويلة PCR ملحق (انظر الجدول للمواد). تحقق من التسلسل.
- لتجنب إعادة توجيه من جرنة إلى مركزا هندسيا، تصميم الجهة المانحة الاستبدال في مثل هذه طريقة أن تتعطل المواقع الاعتراف جرنة بتسلسل خارجية عرض.
ملاحظة: لتجنب تغيير العناصر التنظيمية المستقلة المفترضة، دائماً تحديد المواقع الاعتراف جرنة داخل منطقة إكسون الترميز. -
لتوليد كاسيت استبدال، خطة استراتيجية "الجمعية الحمض النووي" للانضمام إلى أربعة أجزاء معا: في 5 '3' التماثل الأسلحة وتسلسل الحمض النووي ترانساكتيفاتور الخارجية المتوسطة واستنساخ خطية ناقلات العمود الفقري (مثل pUC19 أو غيرها ويشيع استخدام استنساخ متجهات). اتباع إرشادات الشركة المصنعة للجمعية الحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، تصميم كبسولة تفجير مناسبة [بكر] تضخيم والجمعية لكل قطعة. ريسوسبيند الإشعال إلى 100 ميكرومتر مع ddH2O. جعل 10 ميكرومترات عامل تركيز تمهيدي. استخدام بوليميريز عالية الدقة لجميع ردود الفعل PCR. اتباع البروتوكول التالي:
- بكر تضخيم كاسيت تعبير Gal4 أو ليزا من متجه متاحة (مثلاً، nls-LexA:p65؛ يمكن العثور على البلازميدات QF2/Gal4/ليزا مثالية على التعبير والتي تم الحصول عليها من الموارد المشتركة مثل أدجيني) استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 1 باء.
- للاحتفاظ بجميع لوائح النسخي وبوستترانسكريبشونال الأصلي من إكسون حل محل التعبير عن تسلسل الحمض النووي ترانساكتيفاتور، تصميم الكاسيت في مثل هذه طريقة أن اليل الجينوم المحرر عن مرناً تشيميريك ترانساكتيفاتور والجينات. الحفاظ على نهاية 5 'و 3' إكسون المستهدفة الاحتفاظ بأي إشارة الربط.
- إدراج تسلسل ببتيد T2A كليفينج الذاتي بين المتبقية 5 ' ترميز إكسون وتسلسل ترانساكتيفاتور لمنع ترجمة بروتين تشيميريك. إضافة كودون وقف ترجمة بعد التسلسل ترانساكتيفاتور خارجية (الشكل 5).
- [بكر] تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي الجينوم (جدنا) المستخرجة من الأصل يطير الخط المحدد لحقن (مثلاً، غ-Cas9 (على كروموسوم X)، از # 54591) استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 1 باء. استخدام بوليميريز عالية الدقة لجميع ردود الفعل بكر استخدام النظم على النحو التالي: 5 ميكروليتر من 5 x "رد فعل المخزن المؤقت"، ميكروليتر 0.5 من دنتبس 10 ملم، ميكروليتر 1.25 من 10 ميكرومترات التمهيدي إلى الأمام، ميكروليتر 1.25 من 10 ميكرومترات "عكس التمهيدي"، ميكروليتر 0.5 قالب الحمض النووي، 0.25 ميكروليتر من عالية الدقة "دنا بوليميريز" ، ميكروليتر 16.25 ddH2o.
- استخدام ناقل الاستنساخ خطية مثل pUC19. عدد من ناقلات المانحة متاحة الآن. انظر قائمة شاملة في موقع على شبكة الإنترنت--http://flycrispr.molbio.wisc.edu التالية.
- تشغيل المنتجات بكر على 1% [اغروس] هلام. إجراء التفريد لما يكفي من الوقت لضمان فصل واضح للفرقة المرجوة من العصابات غير محددة غير مرغوب فيها (أن وجدت). هلام-تطهير أجزاء الحمض النووي المتوقعة. قياس تركيز كل جزء الحمض النووي المنقي باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
- قم بإعداد رد فعل الجمعية الحمض النووي اتباع إرشادات الشركة المصنعة. خلط الشظايا متجه والهدف الاستنساخ خطية من الخطوة 3 والخطوة 4 في الرد التالي: 1 ميكروليتر من خطي الاستنساخ لأغراض مكافحة ناقلات (50 نانوغرام/ميكروليتر)، 2 – 3 إضعاف الزيادة في كل جزء من الهدف، 10 ميكروليتر من 2 × الحمض النووي الجمعية مزيج الرئيسي، جعل حجم الرد النهائي 20 ميكروليتر مع ddH < c21 > 2O. إينكوباتي ميكس رد فعل لمدة ساعة عند درجة 50 درجة مئوية.
- تحويل 2 ميكروليتر من المنتج الجمعية إلى البكتيريا المختصة، لوحة على رطل/أمبير أجار لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. أيضا، إضافة غال X + إيبتج على لوحة لفحص أبيض وأزرق.
- اختيار 3 – 4 مستعمرات بيضاء من لوحة المحتضنة بين عشية وضحاها وتطعيم مستعمرة مل 3 رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين وتنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في شاكر. دليل لاستخراج بلازميد من البكتيريا مثقف بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة مصغرة الإعدادية بلازميد عقب الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
- شاشة مستعمرة إيجابية بالهضم PCR أو التقييد.
- تسلسل التحقق من المنطقة المانحة HDR من بلازميد النهائي. حفظ مخزون بكتيرية تتحول مع الحيوانات المستنسخة الصحيح في الجلسرين 20% في-80 درجة مئوية لتلقيح مستقبلا.
- بكر تضخيم كاسيت تعبير Gal4 أو ليزا من متجه متاحة (مثلاً، nls-LexA:p65؛ يمكن العثور على البلازميدات QF2/Gal4/ليزا مثالية على التعبير والتي تم الحصول عليها من الموارد المشتركة مثل أدجيني) استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 1 باء.
3. حقن الأجنة وعلم الوراثة يطير والفحص للتحرير الجينوم
- إعداد العالية النقاء خالية من الذيفان جرنة ناقلات التعبير فضلا عن بلازميد المانحة HDR باستخدام ماكسيبريب بلازميد كيت (انظر الجدول للمواد).
- شارك حقن بلازميد التعبير جرنة (100 نانوغرام/ميكروليتر) واستبدال الجهة المانحة (500 نانوغرام/ميكروليتر) في germline من الأجنة Cas9 غ 6. ملاحظة: نحن نستخدم خدمة تجارية للحقن، ولكن يمكن إجراء هذه العملية في المختبر، وكذلك.
-
تحرك لعلم الوراثة والفرز (الشكل 2 و الشكل 3):
- عند حقن الأجنة تتطور إلى الكبار، عبر كل ز واحد0 الذباب للذباب موازن التحميل. حدد موازن مناسبة كروموسوم يحتوي على اليل المستهدفة.
- تخدير F1 ذرية من كل G0 الصليب على لوح2 CO وعشوائياً اختيار الذكور 10-20 تحت ستيريوميكروسكوبي. الصليب منهم على حدة للإناث موازن التحميل كما هو مبين في الشكل 3.
- عندما هاتش اليرقات F2، اختيار الأب F1 واحد من كل الصليب واستخراج جدنا باستخدام الحمض النووي الجينومي يطير واحد إعداد البروتوكول:
- إعداد المخزن المؤقت لاستخراج جدنا: 10 ملم تريس Cl pH 8.2، يدتا 1 مم، 25 مم كلوريد الصوديوم، تخزين في درجة حرارة الغرفة. إعداد 20 ملغ/مل "ك بروتيناز" حل الأسهم وتخزينها في الثلاجة.
- وضع كل ذبابة في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل وتسمية الأنبوب. تبقى في الثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إعداد كمية عامل طازجة من جدنا استخراج مخزن يحتوي على 200 ميكروغرام/مل التركيز النهائي "بروتيناز ك."
ملاحظة: لا تستخدم مخزن قديم لهذه الخطوة. - اسحق كل يطير ل s 10 – 15 مع تلميح ماصة تحتوي على 50 ميكروليتر من سكويشينج المخزن المؤقت دون الاستغناء عن السائل. الاستغناء عن المخزن المؤقت المتبقية في الأنبوب ومزيج جيد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
- وضع الأنابيب في كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 – 2 دقيقة لإلغاء تنشيط "ك. بروتيناز"
- معين باستمرار لمدة 5 دقائق في 10,000 س ز. تخزين إعداد عند 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل PCR.
- استخدام نفس الأسلوب لإعداد جدنا من ذبابة nos Cas9 ، الذي يعمل كعنصر سلبي. أداء شاشات بكر على أساس ثلاث خطوات لتحديد استخدام تقرير التنمية البشرية (الشكل 2، الرقم 5) الصحيح "ينتهي من" جدنا لكل أنثى F1 ك قالب5. استخدم 1 ميكروليتر من الإعدادية الحمض النووي في نظام تفاعل PCR التالية: 10 ميكروليتر من 2 × بكر سيد ميكس مع صبغ، 1 ميكروليتر من كل التمهيدي (10 ميكرومترات)، 1 ميكروليتر من قالب الحمض النووي، وميكروليتر 7 ddH2o.
- كما هو موضح في الشكل 5A، إجراء PCR باستخدام fwd1 الإشعال و rev1 إلى الشاشة لوجود الإدراج أو الاستبدال؛ إجراء PCR باستخدام كبسولة تفجير fwd2 و rev2 للتحقق من الإدراج أو الاستبدال من 3 ' المنطقة؛ إجراء PCR باستخدام كبسولة تفجير M13F و rev3 للتحقق من "ينتهي في" تقرير التنمية البشرية (الجدول 1).
- الحفاظ على خطوط الطيران مع HDR من الغايات المؤكدة وإنشاء مخزون متوازنة من جيل F2. التهجين على الذباب موازن التحميل مرة أخرى لإزالة أي الطفرات غير مقصودة في الكروموسومات الأخرى.
-
إعداد جدنا عالية الجودة من الأرصدة الثابتة لتضخيم بكر الطويل (> 800 – 1,000 nt) amplicon مع بوليميريز بوليميراز عالية الدقة والتسلسل الكامل التحقق من أمبليكونس التي تم الحصول عليها من مناطق الجينوم هندسيا. وبدلاً من ذلك، استخدم استخراج النفط الخام جدنا كما هو موضح في وقت سابق إلى تضخيم أقصر (< 800 nt)، تداخل منتجات PCR للجينوم المحرر التحقق من التسلسل. باستخدام بروتوكول التالية للتحضير الجيد المورفولوجية المجينية الحمض النووي:
- حوالي 25 من الذباب الكبار في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وتجميد في الثلاجة-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- إضافة 250 ميكروليتر من الحل A (pH 9.0 تريس HCl 0.1 M، يدتا م 0.1، الحزب الديمقراطي الصربي 1%).
- مجانسة الذباب باستخدام المدقات المتجانس في أنابيب ميكروسينتريفوجي، ووضعت الأنبوب على الجليد.
- تبني على 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 35 ميكروليتر كوك (5 م) ويهز المزيج جيدا، ولكن لا دوامة.
- تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- تدور في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة.
- مع ميكروبيبيتي 1 مل، بعناية نقل المادة طافية واضحة فقط إلى أنبوب جديد، ترك مرة أخرى أي متسرعا أو الطور البيني.
- إضافة 150 ميكروليتر من الايزوبروبانول للمادة طافية. المزيج بلطف بانعكاس.
- تدور في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة المادة طافية وترك بيليه في الأنبوب.
- أغسل بيليه مع 1 مل 70% EtOH.
- تدور في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية. الهواء الجاف بيليه لمدة 15 إلى 20 دقيقة. لا جاف أكثر بيليه.
- حل بيليه في 100 ميكروليتر ddH2o.
- استخدام عالية الدقة بوليميراز الدنا مناسبة ل amplicon طويلة (> 800 شركة بريتيش بتروليوم) لتضخيم المنطقة المحررة كاملة. ومن الناحية المثالية، أن كبسولة تفجير اثنين خارج كاسيت المدرج تضخيم منطقة الجينوم. هلام تنقية المنتج بكر، وكما هو موضح سابقا، تسلسل التحقق من المنتج مع الإشعال متداخلة متعددة.
-
التحقق من صحة أنماط التعبير الزمانية المكانية الصحيحة من تشريح أنسجة الأجنة/خطوط الطيران هندسة:
- أداء RT-PCR من الجيش الملكي النيبالي إجمالي للتحقق من التعبير عن المنتج مرناً الهجين (الجدول 1).
- إجراء تهجين في الموقع للمنتج مرناً للمصلحة في الأنسجة/الجنين اليرقات للتحقق من صحة التعبير.
- على الشاشة لأنماط التعبير الزمانية المكانية الخاصة بالانسجة الدقيقة بين خطوط تنتهي التحقق من التسلسل، عبر كل من الخطوط التي تم تحريرها تم الحصول عليها لبرنامج تشغيل التعبير ثنائي مع لكسو-التجارة والنقل أو لكسو-طلب تقديم العروض (بالنسبة ليزا سائق) خط (متاح من مراكز الأسهم بلومينغتون) ومراقبة ليزا أو Gal4 مدفوعة التعبير الجيني مراسل في أنسجة الجنين، اليرقات، والكبار تحت مجهر الأسفار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول استخدمت بنجاح لإنشاء تعبير ثنائي المستهدف مراسل نظام محدد ل bnl معربا عن الخلايا5. رابطة الدول المستقلة-لا تتسم العناصر التنظيمية (CREs) التي تتحكم في التعبير الزمانية المكانية المعقدة bnl . ولذلك، صمم إكسون الترميز الأول فقط من bnl تحقيق التعبير الزمانية المكانية تحت سيطرة الذاتية bnl التسلسل التنظيمي، للاستعاضة بتسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية. واختير كاسيت تحسين nls LexA::p65 المعروفة لتقديم التعبير الأمثل في المورفولوجية .
استبدال استراتيجية تهدف إلى توليد تشيميريك nls-LexA:p65-bnl مرناً تحت سيطرة الترانسكربتي وبوستترانسكريبشونال الذاتية. هذا مرناً تشيميريك الواردة حالها bnl 5 'UTR، جزءا من النهاية 5' 3 ' نهاية المحرر bnl ترميز إكسون (إكسون الأولى)، وإكمال المصب bnl introns و exons. للحفاظ على الربط bnl الخاصة بالحمض النووي الريبي من إكسون استبدال، أبقى صغيرة نهايات 5 'و 3' إكسون كتابة التعليمات البرمجية استبدال. ومع ذلك، لمنع توليف بروتين Bnl تشيميريك تنصهر فيها nls-ليزا: p65، T2A ذاتيا ناهضة الببتيد تسلسل أدرج بين تبقى 5 ' bnl ترميز المنطقة و ATG من nls-LexA:p65. أيضا، أضيفت كودون وقف ترجمة بعد nls-LexA:p65 تسلسل لتجنب الترجمة المشارك مبتوراً Bnl البروتين5 (الشكل 4 و الشكل 5 ألف).
استخدمت إحدى الجهات مانحة استبدال التي تحتوي على كافة هذه الميزات، والذي كان T2A-nls-LexA:p65 تسلسل و 2 كيلو بايت 5 '-و 1.8 كيلو بايت 3'-الأسلحة التماثل. استخدمت الأسلحة التماثل طويلة لكفاءة HDR والإدراج من الحمض النووي جزء كبير في الموقع لإصلاح (T2A-nls-LexA:p65 1.8 كيلو بايت) (الشكل 5 ألف).
جرناس اثنين المستخدمة لإنشاء دسبس في مواقف محددة لحذف معظم إكسون الترميز الأول من bnl. جرناس اثنين مطابقة لجميع المعايير المبينة في الفرع 1-3 (تسلسل بام وأكد) ما يلي:
gRNA1: تجتاتكتجكجاتجككككتكاتج
gRNA2: أتككتكاجاتاتجكججاتج
كلا الموقعين الاعتراف جرنة تعطلت في الجهة المانحة الاستبدال ب الخارجية T2A-nls-LexA:p65 التسلسل، الذي هو أسهل طريقة لتجنب إعادة توجيه من جرناس إلى مركزا هندسيا. وكانت تسلسل الاعتراف جرنة تعطلت في استبدال الجهة المانحة (تسلسل الخارجية التي تعطل جرنة الاعتراف بالمواقع بخط مائل):
gRNA1: تجتاتكتجكج-جكتككجكجاجاك...
gRNA2:... آآآآكتكجتتاجا-كججاتج
ناقل التعبير جرنة pCFD4 التي تحتوي على هذه جرناس، جنبا إلى جنب مع الجهة المانحة الاستبدال، تم حقن شارك في germline غ Cas9 الأجنة. وأعقب بعد ذلك البروتوكول الموصوفة هنا على الشاشة لاستبدال المقصود (الشكل 5، ج). وكانت حوالي 67 في المائة من حقن الحيوانات G0 خصبة. وكانت 56% G0s الخصبة المؤسسين، التي أدت إلى ذرية الحاملات لتقرير التنمية البشرية. بين ذرية F1 التحقق، حوالي 23 في المائة كانت إيجابية بالنسبة لنجاح تقرير التنمية البشرية، وكانت 73% من تقرير التنمية البشرية الإيجابية "ينتهي إلى الخارج" (الجدول 2). منذ أول ترميز إكسون bnl "طرقت"، وتم العثور على كافة بنود تقرير التنمية البشرية أن يكون متماثل وأبقى الفتاكة، والأرصدة السمكية عبر balancers.
تم التحقق من صحة توليد مرناً bnl ليزا تشيميريك في الخلايا بتحليلات RT-PCR (الشكل 5). للتحقق مما إذا كان حصل على bnl-خطوطليزا كانت أعربت في نمط التعبير الذاتية bnl ، كل سطر "ينتهي إلى الخارج" تقرير التنمية البشرية قد عبروا إلى متشيريكاكس لكسو الذباب وراثيا5، ونمط التعبير مراسل وكان بحث في ذرية الأجنة واليرقات. وأظهرت خطوط 42 من أصل 46 دقيقة التعبير الزمانية المكانية تتفق مع أنماط سبق الإبلاغ عنها bnl 5 (الشكل 6). وأظهرت أربعة خطوط أما أنماط التعبير ضعيفة أو غير محددة. ونتوقع أن هذه الخطوط قد تراكمت الطفرات التي نحن بحاجة إلى التحقق من تحليلات تسلسل دقيق. معا هذه النتائج أكدت أن استراتيجية استبدال إكسون HDR بوساطة يمكن استخدامها بنجاح لإنشاء نظام تعبير ثنائي المستهدف لجينات. يمكن استخدام الأداة للتعبير عن مراسل أو حمل خارج الرحم الجينات في الأنماط الزمانية المكانية للجينات bnl بنجاح.
رقم 1: مخطط نظام النسخ ثنائي للتعبير الجيني المستهدف. ترانساكتيفاتور (GAL4 أو ليزا)، أعرب تحت السيطرة رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية (كريس) الجينات، يدفع التحوير المستجيب وضع المتلقين للمعلومات من مواقع الربط النسخ المحددة (UAS ل Gal4 أو ليكساوب ليزا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: لمحة عامة عن سير العمل للجينوم كريسبر/Cas9-بوساطة تحرير لإنشاء نظام نسخ ثنائي- تتم الإشارة إلى المدة الزمنية التقريبية اللازمة لكل خطوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مثال على كريسبر الفرز والوراثية عبر خطة لإنشاء خطوط الطيران الجينوم في تحريره. في الصلبان الوراثية، يقف R لاليل المحرر الموجود على كروموسوم 3rd . مكرس (السيدة Tp (3، 3)، م (3) 76A ry كار [1] [1] [2] س [1])، علامة كروموسوم 3rd ؛ TM6B (في TM6B (3LR)، أنتب [هو] ه [1] Tb[1]) موازن كروموسوم 3rd . يتم التحقق من الجينوم تحرير الأرصدة يطير بتضخيم المناطق المستهدفة من اهتمام الحمض النووي المستخرج من الذباب الجيل F2 أو F3 وتسلسل تحديد المنتجات بكر بكر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: جيل كاسيت استبدال الجمعية الحمض النووي- رسم تخطيطي يصور [بكر] تضخيم وتجميع منتجات PCR مختلفة (أ، ب، ج) إلى الموجه المانحة (د) استخدام أسلوب الجمعية الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: توليد bnl-ليزا باستبدال إكسون كريسبر/Cas9-بوساطة. (أ) التخطيطي رسم تصور استراتيجية كريسبر/Cas9 بوساطة تقرير التنمية البشرية لاستبدال إكسون في موضع bnl . مربع-إكسون؛ خط-إنترون؛ وعرضت الجهات المانحة استبدال (بدونور-bnl:LexA) واثنين من النتائج المحتملة لتقرير التنمية البشرية. بدونور-bnl:LexA بالميزات التالية: (1)T2A-nls-LexA:p65 تسلسل (~1.8kb) يحيط بها 2 كيلو بايت و 1.8 كيلو بايت طويلة التماثل الأسلحة (خطوط متقطعة)، (2) ببتيد T2A كليفينج الذاتي بين إكسون المحطة الطرفية bnl ن المتبقية و nls-LexA:p65، و (3) كودون وقف ترجمة (الأحمر *) بعد nls-LexA:p65 تسلسل. المنتج تقرير التنمية البشرية الإبقاء على كل سيطرة bnl،وليزاالنسخي وبوستترانسكريبشونال: p65 البروتين من المتوقع أن تنتج في نفس النمط كما الذاتية Bnl الصغيرة السوداء الأسهم تظهر مواقع الربط النسبي (ليس في مقياس) كبسولة تفجير PCR المستخدمة لفحص 3-خطوة أو التحقق من صحة RT-PCR (الجدول 1). (ب) [اغروس] هلام صور تظهر نتائج فحص PCR الخطوة 3. يتم عرض منتجات PCR يضخم من الحمض النووي الجينومي لأربعة خطوط HDR ينتهي نجاح؛ السلبية السيطرة، الحمض النووي من غ-Cas9 خط الوالدية؛ مراقبة إيجابية، بدونور-bnl:LexA بلازميد؛ M، علامة (سلم الحمض النووي SL2K). (ج) مثال من جل الفحص عرض المنتج بكر المتوقعة باستخدام كبسولة تفجير M13F و rev3 لينتهي في سطور؛ M8--7 و M9-6 هي اثنين في نهايات الأسطر؛ عناصر سلبية وإيجابية، هي نفسها كما في ب؛ M، علامة (NEB 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي). (د) تحليل RT-PCR في مجموع الجيش الملكي النيبالي من bnl-ليزا والسيطرة nos Cas9 الذباب. التمهيدي إلى الأمام بربط منطقة محددة ليزا ، عكس التمهيدي بربط منطقة المصب bnl إكسون؛ ~ تم الكشف عن عصابة التضخيم bp (زوج قاعدي) 440 (*) من الرايت-بكر على bnl-ليزا مرناً، ولكن ليس من سيطرة الجيش الملكي النيبالي. م، 100 شركة بريتيش بتروليوم ماركر (NEB). مقتبس من الأرقام 2 و S1 في دو وآخرون. 5من عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: التحقق من صحة التعبير الخاصة بالانسجة والشرطي bnl-ليزا في أنسجة مختلفة. (أ-د) bnl التعبير (أحمر) في أنسجة اليرقات مختلفة، مع زجاجة معربا عن خلايا تظهر باللون الأخضر. (أ، أ ') الجناح القرص المصدر bnl قبل بريمورديوم كيس الهواء المتزايد (ASP). (ب، ج) التعبير bnl في TR5 عرضية الضامة (TC) (ب) وفرع الظهرية TR2 (DB) (ج). (د) التعبير bnl في أقراص الأعضاء التناسلية للإناث. (ه-ي) التعبير الديناميكي bnl (أحمر) خلال الزخرفة فرع الرغامى الجنينية (الأخضر)؛ الأسهم الصغيرة، خمسة مصادر bnl المحيطة لوحاء الرغامى في المرحلة 10. الأنماط الوراثية: أ-ي؛ زجاجة-Gal4، UAS- CD8GFP/+؛ bnl-ليزا، لكسو- تشيريكاكس/+. (K-L ") نقص–بفعل bnl-ليزا التعبير الشخصية في أقراص الجناح والمرتبطة ميتاميري TR2 الرغامى (TC، DB، DT الجذع الظهرية). النمط الوراثي: bnl-ليزا، لكسو-تشيريكاكس/+. (ك) مراقبة الأقراص من السابقين فيفو مثقف الأجهزة دون كوكل2. أقراص الجناح (L-L ") (L، L') والقصبة الهوائية (DT، (ل '')) من المثقفين السابقين فيفو الأجهزة مع كوكل2 التي يسببها نقص. التعبير نجمة، حمل خارج الرحم الناجمة عن نقص. تغيير حجم أشرطة = 30 ميكرومتر؛ 50 ميكرومتر (K-L "). مقتبس من الشكل 3 في دو وآخرون. 5من عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| جرنة أ-الاستنساخ والتسلسل | |
| إعادة توجيه جرنة bnl-ليزا |
تاتاتاجااجاتاتككججتجاكتكج تجتاتكتجكجات جككككتكاجتتتاجاجكتاجااتاجكاج |
| القس جرنة bnl-ليزا |
أتتتتاكتجكتاتتكتاجكتكتاااك تكككجكاتاتكتجاج فيكجاكجتااتجاااتاجتك |
| التمهيدي T3 المستخدمة للتسلسل | كاتى أكككتكاكتااج-3 ' |
| ملاحظة: يصلب النيوكليوتيدات أكد U6 المروج أو الأساسية جرنة على ناقل pCFD4، حرف g/c تمت إضافة إلى المعونة النسخ المعتمدة على مروج U6 | |
| ب تقرير التنمية البشرية المانحة البناء | |
| bnl N-F_pUC19 | آتتكجاجكتكجتاكتجتجتكتتجاجكتجاك |
| bnl-ليزا-N-R |
تككجكاجتكاجتاجكتجككجكجتككتكجككجاجكك كجكاجاتاكاجككك ج |
| ليزا-F |
كتاكتجاكتجكجاجاتجتكجاجاجاكككتجكككت أتجككاكككا جاجاجك |
| ليزا-R | كتااكجاجتتتتاجكااكتكاكتك |
| الموجه إليه bnl ليزا-ج | تااااكتكجتتاجاكججاتجكجتجتكاك |
| bnl ج-R_pUC19 | جككاجكتجكاتجككتكجكاتاتجككجككتج |
| ملاحظة: تم النيوكليوتيدات في رأس المال من التداخل مع ناقل pUC19 "الجمعية جيبسون"، النيوكليوتيدات وأكد تسلسل المتراكمة لإضافة الببتيد T2A. | |
| جيم فحص HDR والتسلسل | |
| scr bnl-ليزا fwd1 | جتجكجكاكجكككاتااك |
| rev1 scr bnl-ليزا | جاتكككاجككاتكتككجتج |
| scr bnl-ليزا fwd2 | كاكجاجاتجكتججاتك |
| rev2 scr bnl-ليزا | كتجككاكتجتاججاجتك |
| rev3 ينتهي في الاختيار | جكاتجتاتجكاتجكجتجاك |
| ليزا bnl seq fwd3 | كاكتجتكجكككاتاتجاتاكاتج |
| ملاحظة: استخدمت هذه كبسولة تفجير لبكر الفرز وتسلسلها، تظهر المواقع التقريبية لمواقع الربط التمهيدي في الشكل 5A ك fwd1-2، و rev1 3. | |
| دال تحليل RT-PCR | |
| RT-f | جاتاتجاتتكتككجكتتجكتج |
| RT-r | ككاتجكاجاجاتاكاجكاجتج |
الجدول 1: الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة. (أ) كبسولة تفجير للاستنساخ لأغراض مكافحة ناقلات التعبير جرنة وتسلسلها. (ب) كبسولة تفجير لاستنساخ قالب المانحة تقرير التنمية البشرية. (ج) كبسولة تفجير للفرز والتسلسل من المنتجات تقرير التنمية البشرية. (د) أجهزة الإشعال المستخدمة للتحقق RT-PCR المنتج مرناً bnl ليزا تشيميريك.
| النمط الوراثي | % معدل انتقال HDR (الغلة HDR G0 خصبة G0/# #) | # فحص F1 مجموع F1/# مصابات بتقرير التنمية البشرية (%) | # "ينتهي إلى الخارج" تقرير التنمية البشرية/# إجمالي تقرير التنمية البشرية (%) |
| ليزا bnl | 56 (15/27) | 23 (60/259) | 73 (46/60) |
الجدول 2: كفاءة كريسبر/Cas9-بوساطة HDR- ويحسب معدل انتقال HDR # من الغلة HDR G0/# من مجموع G0 خصبة. يحسب نجاح HDR % # لتقرير التنمية البشرية--الإيجابية F1/# من مجموع F1 فرزهم. يحسب % "ينتهي إلى الخارج" # "ينتهي إلى الخارج" تقرير التنمية البشرية/# إجمالي تقرير التنمية البشرية الإيجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقليديا، تم إنشاؤها المورفولوجية محسن الفخاخ بطريقتين مختلفتين. واحدة من الطرق تشمل الإدراج عشوائي من برنامج التشغيل (على سبيل المثال.، Gal4) تسلسل جينوم بتبديل (مثلاً.، تبديل عنصر P)1 . بدلاً من ذلك، يمكن وضع تسلسل سائق تحت سيطرة منطقة محسن/المروج المفترضة في بناء بلازميد، التي ستدمج في موقع خارج الرحم من3،الجينوم11ثم النسخي. على الرغم من أن هذه الأساليب قد ولدت مجموعة كبيرة من Gal4 أو الفخاخ محسن ليزا المورفولوجية، لديهم العديد من القيود. الإدراج عشوائي فعنصر-بوساطة في الجينوم قد تعطل النشاط التنظيمي ل الحرج رابطة الدول المستقلة-تسلسل تنظيمي. بسبب تبديل عشوائي في الجينوم، قد تقرير التعبير ترانساكتيفاتور أنماط متعددة الجينات المجاورة. من ناحية أخرى، علم مسبق بتسلسل الجين رابطة الدول المستقلة التنظيمية أمر ضروري لمقولة أساسية بلازميد فخ محسن. وهناك أيضا حد أقصى لطول تسلسل يمكن استنساخ واختبارها في بناء بلازميد. عزل واستنساخ جزء جزئية فقط للحمض النووي خارج سياق الجينوم الذاتية قد لا تتكاثر أنماط تعبير الخاصة بالجينات كاملة. على سبيل المثال، لا تتكاثر الخط bnl-Gal4 (NP2211)، والتي تم إنشاؤها بواسطة عنصر ف الإدراج لاعتراض محسن Gal4 العنصر قبل الجين bnl ، أنماط التعبير الخاصة بالجينات في الجنين5 تماما . ولذلك، ضمن هذه السياقات، repurposing التقنيات، مثل الاختراق (التماثل وساعد كريسبر تدق في)، أن يمكن خطوط تحويل Gal4 الموجودة في ليزا أو Q-نظام آخر يقوم برنامج تشغيل خط12 قد لا تكون مفيدة للغاية. للتغلب على هذه القيود، هنا، يمكننا وصف طريقة فعالة وبديلة لتوليد نظم ثنائية التعبير عن طريق تحرير الجينوم. في هذا الأسلوب، هو تبادلت إكسون الترميز الأول الجينات مع ترانساكتيفاتور (على سبيل المثال.، ليزا أو Gal4) تسلسل ذلك للتعبير عن برنامج التشغيل النسخ حصرا يحاكي الأنماط الزمانية المكانية للتعبير الجيني. وبالرغم من أن الاستراتيجية والبروتوكولات المذكورة هنا هي الأمثل ل bnl-التعبير، يمكن اعتماد الطريقة بسهولة لجينات أخرى.
تحديد موقع إدراج داخل منطقة الجين المستهدف هو الخطوة الأكثر أهمية في هذه الاستراتيجية التجريبية. طريقة عرضنا يهدف إلى الاحتفاظ بجميع الأصلي النسخي فضلا عن اللوائح بوستترانسكريبشونال من الجينات bnl 5. ولذلك، خططنا لحذف معظم إكسون الترميز الأول من الجينات bnl واستبداله بكاسيت ليزا . كان من المقرر الاستبدال في مثل هذه طريقة أن اليل المحرر تعرب عن هجين ليزا-bnl مرناً من النسخ الذاتية والترجمة بدء موقع bnl مع الاحتفاظ بجميع المناطق إينترونيك. ومع ذلك، هجين تم تصميم مرناً لإنتاج البروتين ليزا فقط، ولكن لا Bnl. لقد أظهرنا أن هذه الاستراتيجية قد ولدت بنجاح bnl-ليزا /لكسو-استناداً إلى نظام النسخ وأن هذا النظام يمكن تقرير دقيق أنماط التعبير الديناميكي، والزمانية المكانية bnl (الشكل 5)5 . حد من هذه العملية هو الفتك متماثل في الخطوط المورفولوجية إذا كان الجين المستهدف ضروري للبقاء على قيد الحياة. علاوة على ذلك، قد زيادة استخدام استراتيجية مزدوجة جرنة فرصة للتحرير خارج الهدف. ويمكن استخدام استراتيجية بديلة لتجنب هذه المشاكل. كاسيت ليزا أو Gal4 يمكن في هذه الاستراتيجية، ووضع الحق في موقع بدء ATG استبدال الجينات و T2A الذاتي ناهضة الببتيد تسلسل يمكن أن توضع بين الكاسيت ليزا/Gal4 وبدء إكسون الترميز سليمة من الجين المستهدف. من المتوقع أن تنتج مرناً تشيميريك التي يمكن أن تترجم ترانسكتيفاتور والمنتج الجينات الوظيفية هذه الاستراتيجية. ويمكن تقليل هذا تصميم ربما فرصة للفتك متماثل. في هذه الاستراتيجية، جرنة واحدة كافية لتحرير الجينوم. ومع ذلك، وجود نسختين من الجينات الوظيفية، والتعبير عن المتغيرات المعدلة وراثيا بروتين يقودها سائق Gal4/ليزا (على سبيل المثال.، ليزا bnl مدفوعة التعبير عن لكسو-Bnl: بروتينات فلورية خضراء الأنشطار، أو البروتينات Bnl مع الحذف) لن تقدم معلومات الأداء الوظيفي للبروتينات متغير.
تحديد استراتيجية التحرير الجينوم هو عملية شاقة لاستهداف والتحرير لجينة واحدة في وقت واحد. ومع ذلك، ثورة البساطة والكفاءة كريسبر/Cas9-بوساطة الجينوم أسلوب التحرير المستهدفة الجينوم تدق-في/المغلوب واستبدال التكنولوجيا التي يمكن اعتمادها بسهولة في أي مختبر معيار إعداد. في السنوات القليلة الماضية، قد طور الباحثون المورفولوجية أدوات ملائمة للجينوم التحرير التي يمكن استخدامها لتوسيع toolsets الوراثية الضرورية لفهم العمليات البيولوجية الأساسية7،13 . الجينوم التحرير وفحص العمليات الموصوفة هنا هو أسرع نسبيا ويأخذ حوالي شهرين بالمقارنة مع أي أخرى مثلى المستندة إلى جزئ الاستبدال. لنتائج التحرير الجينوم ناجحة وفعالة، من المهم اتباع العديد من الخطوات الهامة من الناحية التقنية: 1) يتم تحديد كل جرنة بأقصى صرامة والنشاط دون إمكانية إيقاف المستهدفة؛ 2) الجهة المانحة HDR يحتوي على ~1.5 كيلو بايت التماثل الأسلحة المرافقة جرنة استهداف المواقع. وتستخدم الأسلحة التماثل أطول (1.8 – 2 كيلو بايت) زيادة كفاءة HDR عندما يحتاج جزء الحمض النووي خارجية كبيرة لإدراجها؛ 3) الجهة المانحة HDR مصممة لتكون خالية من المواقع الاعتراف جرنة لتجنب إعادة توجيه من جرنة إلى مركزا هندسيا؛ و 4) خطة مفصلة مضمونة وتنسيق توقيت الصلبان الوراثية مع الفرز المستندة إلى بكر 3-خطوة لتحديد بند تقرير التنمية البشرية "ينتهي إلى خارج".
خلافا لتبديل عشوائي أو بنيات محسن المستنسخة، الاستراتيجية والبروتوكولات التي وصفناها هنا يضمن توليد استهداف نظام النسخ ثنائي الجينات محددة حصرا. حيث يستبدل التعبير عن برنامج التشغيل من إكسون جينات أصلية، التعبير الخاصة بالجينات للسائق هو أيضا تنوعاً ومن المتوقع أن تقليد أنماط التعبير الجيني تحت جميع الظروف الإنمائية والايض، والفسيولوجية5. التعبير الجيني/خلية معينة هي المعايير الأكثر استصواباً لكافة بنود التشغيل الثنائي عند استخدامها في الخلية وعلم الأحياء التنموي أساليب مختلفة. على سبيل المثال، يسهل التعبير الخاصة بالجينات الجينات مراسل سائق نسخ تحليلات النسب الموثوقة للخلايا التعبير عن الجين المستهدف. ويمكن أيضا التصوير حية وتتبع التعبير الزمانية المكانية، والهجرة، وإعادة التنظيم للخلايا أثناء التطوير. للتحقيق في الأحداث الجزيئية والخلوية خلال الأنسجة morphogenesis، Gal4 أو ليزا مدفوعة أوفيريكسبريشن/ميسيكسبريشن المتسلسلات والجينات [رني] بوساطة تدق لأسفل في مجموعات محددة من خلايا مختلفة ضرورية. ويوفر نظام التعبير مستهدفة محددة للغاية غير منحازة التحليلات وتفسير النتائج. ولذلك، كريسبر/Cas9-على أساس استهداف إكسون جينات والاستعاضة عنها بتسلسل ترانساكتيفاتور توفر بديلاً أفضل لتوليد أنظمة تعبير الجينات المستهدفة محددة للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ف. منفذ والدكتور ك. أوكونور-جايلز الدكتور س. فنغ للمناقشات بشأن الاستراتيجية كريسبر؛ الدكتور يد كورنبرغ، ومركز الأسهم بلومينغتون الكواشف؛ الخفة في التصوير المرافق الأساسية؛ وتمويل من المعاهد الوطنية للصحة: R00HL114867 و R35GM124878 بريال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10% SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M.
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), Bethesda, Md. 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
