만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과
Summary
만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
만성 림프모구 백혈병 (CLL) 악성 B 세포 복제품 확장 특징 이다 고 서방 국가에서 가장 흔한 백혈병을 나타냅니다. CLL 환자의 대다수는 질병의 나태 한 과정 뿐만 아니라 그들의 백혈병 세포의 anergic 형 B 세포 수용 체 외부 자극에 응답을 참조를 표시 합니다. 우리는 최근 녹음 방송 요인 NFAT2 CLL에 아의 중요 한 레 귤 레이 터가 나타났습니다. 다른 질병에서 녹음 방송 요인의 역할의 분석의 주요 과제는 그것의 특정 대상 유전자의 id입니다. 이 pathogenetic 메커니즘 및 잠재적인 치료 내정간섭의 해명에 대 한 큰 의미입니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 단백질 DNA 상호 작용을 설명 하는 고전적인 기법 이며 포유류 세포에 있는 녹음 방송 요인의 직접적인 대상 유전자를 식별 하는 데 따라서 수 있습니다. 여기, 칩 인간 CLL 세포에 NFAT2의 직접적인 대상 유전자로 LCK 를 식별 하기 위해 사용 되었다. DNA와 관련 된 단백질 포름알데히드를 사용 하 여 가교 된 이며 이후 쥡니다 대략 200-500의 기본적인 쌍 (bp)의 DNA 파편에 의해 전단. NFAT2와 관련 된 상호 연결 된 DNA 파편은 다음 선택적으로 αNFAT2 항 체를 사용 하 여 셀 파편에서 immunoprecipitated. 정화, 후 관련된 DNA 파편은 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 검색 됩니다. 분명 농축 된 DNA 시퀀스 NFAT2에서 비보에의해 타겟으로하는 게놈의 지구를 대표 한다. DNA와 필요한 항 체의 선택의 적절 한 전단 하는 것이이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 특히 중요 합니다. 이 프로토콜은 대상 유전자와 NFAT2의 직접적인 상호 작용의 데모에 이상적입니다. 그것의 주요 한계는 그대로 생물의 여러 전사 인자 들의 대상 유전자 분석 대규모 분석에 칩을 사용 하는 데 어려움.
Introduction
만성 림프모구 백혈병 (CLL) 나타냅니다 서방 국가 있는 성인에서 가장 흔한 백혈병,1세포 성숙 B 표현 CD19, CD23, 그리고 CD5의 고유한 축적을 전시. 대부분의 환자 들은 몇 년에 대 한 구체적인 치료를 필요로 하지 않는다는 나태 한 질병 과정을 전시 한다. 반면, 일부 환자는 면역 화학요법 또는 다른 표적으로 한 치료2,3즉각적인 치료 내정간섭을 요구 하는 빠른 진행을 보여줍니다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요소는 다양 한 발달을 조절 하는 전사 인자와 수많은 셀 종류4,,56활성화 프로세스의 집합입니다. 우리가 최근에7나태 한 질병 가진 환자에서 overexpression 헌법의 및 활성화 CLL 세포에 NFAT2 보여 주었다. 여기, 그것은 라는 아7B 세포 수용 체 자극에 응답 하지 않는 상태를 조절. NFAT2에 림프 톨 특정 단백질 티로신 키 니 아 제 (LCK) 발기인 및 인간 CLL 세포, 특정 chromatin immunoprecipitation 분석 결과에서 LCK 식 조절 (칩) 개발 및 고용.
칩은 유전자 표현8에 녹음 방송 요인의 역할을 조사 하기 위해 여러 가지 기술 중 하나. 유전자 발현은 밀접 하 게이 과정9,10,,1112에 대신할 참여 하는 전사 인자와 매우 복잡 한 방식으로 여러 규제에 의해 조율 된. 공간과 시간적 맥락에서 유전자 발현을 조절 하는 전사 인자에 수많은 종 (예를 들어, 개발 및 차별화)13,,1415, 발견 되었습니다. 16,,1718. 오류와 관련 된 녹음 방송 요인 복잡 한 제어 메커니즘에 암19,20를 포함 하 여 pathologic 프로세스의 다양 한 발생할 수 있습니다. 따라서, 녹음 방송 요인 및 그들의 각각 대상의 식별 소설 치료 길21,22를 제공할 수 있습니다. 이 흥미로운 분야를 조사 하기 위해 여러 가지 방법을 칩, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 다양 한 DNA 풀 다운 분석 실험 및 기자-분석 실험8,,1112, 처럼 사용할 수 있습니다. 23 , 24.
특정 전사 인자는 게놈의 특정 지역 상호 작용 입증을 vivo에서 칩 이상적인 기술25입니다. 이 위해 DNA와 살아있는 세포에 관련 된 단백질은 십자가 UV 방사선 조사 또는 포 름 알 데히드 (상호 연결 된 칩, XChIP)를 사용 하 여. 이 단계는 더 나은 DNA 및 단백질 복구 소위 기본 칩 (NChIP)26에서 생략 됩니다. DNA 단백질 복합물은 이후 약 200-500의 기본적인 쌍 (bp)와 관심의 녹음 방송 요인에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 셀에서에서 immunoprecipitated의 파편으로 쥡니다에 의해 전단. 그리고 나 서 연결 된 DNA 파편 정화 PCR, 분자 클로닝 및 시퀀싱에 의해 특징. 대체 기술을 사용 하 여 microarrays (칩-온-칩) 또는 다음-세대 시퀀싱 (칩 Seq) immunoprecipitated DNA를 분석.
칩 길모어에 의해 처음 도입 및 1984 그들은 UV를 사용 하는 경우에 Lis covalently 상호 연결 DNA 빛과 생활에 단백질을 바운드 박테리아27. 세포 세포의 용 해 및 세균성 RNA 중 합 효소의 immunoprecipitation, 알려진된 유전자의 특정 프로브는 vivo에서 유통 및 RNA 중 합 효소의 밀도 매핑하는 데 사용 되었다. 방법은 진 핵 RNA 중 합 효소 II 열 충격 단백질 유전자 초파리28의 분포를 분석 하 같은 수 사관에 의해 연속적으로 사용 되었다. XChIP 분석 결과 Varshavsky와 동료 처음 열 충격 단백질 유전자29,30와 H4 히스톤의 협회를 공부 cross-linking 포름알데히드를 사용 하 여 더 세련 되었다. 때문에 자연스럽 게 그대로 epitopes 더 나은 DNA와 단백질 복구의 이점을 운반 NChIP 접근 및, 따라서, 더 큰 항 체 특이성, 처음 Hebbes와 동료 198831에 의해 설명 되었다.
칩의 DNA 단백질 상호 작용 분석을 다른 기술에 비해 장점은 사실, 녹음 방송 요인의 실제 상호 작용 수 조사 비보에 아무 프로브 또는 버퍼 또는 젤에 의해 만들어진 인공 조건 8,,1112고용. 차세대 시퀀싱 칩을 결합 하 여 여러 개의 목표를 동시에 확인할 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 그대로 생물25에 대규모 분석을 그것의 제한 적용. 도전만 수준 낮은 또는 좁은 시간 창 동안 각각 단백질 표현 됩니다 경우 칩 기술을 사용 하 여 차동 진 식 패턴의 분석 될 수 있습니다. 또 다른 잠재적으로 제한 요인은 적절 한 항 체 칩11적합의 가용성 이다.
여기에 제시 된 칩 프로토콜 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)으로 대상 유전자의 녹음 방송 요인의 비보에 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 특히, 목표 CLL에 NFAT2의 소설 대상 유전자를 확인 했다. 칩은 직접 인간의 CLL 환자 세포의 자연 조건 하에서 다른 대상 유전자의 발기인 지구에 NFAT2의 바인딩을 보여에 그것의 잠재력 때문에 선택 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 칩 분석 실험을 수행의 중요 한 단계는 적절 한 항 체의 선택과 과정25전단 chromatin의 최적화. ΑNFAT2 항 체의 선택이이 프로토콜의 개발 중 특히 어려운 것으로 판명. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 αNFAT2 항 체와이 작품 부 럽 잘 및 다른 응용 프로그램의 대부분은, 복제 7A6 칩7성공적으로 사용 될 수 있는 유일한 항 체 했다. 도 살 일 걸 요 다른 제조 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DFG에 의해 지원 되었다 뮤 3340/1-1과 도이치 Krebshilfe 111134 (둘 다 M.R.M.에 게 수 여 하는) 부여 부여. 우리 감사 Elke Malenke 우수한 기술 지원).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Riferimenti
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