Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica
Summary
Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.
Abstract
Leucemia linfocítica crónica (LLC) se caracteriza por la expansión de clones de células B malignas y representa la leucemia más común en los países occidentales. La mayoría de los pacientes CLL muestra un curso indolente de la enfermedad, así como un fenotipo anérgico de sus células de la leucemia, refiriéndose a un receptor de la célula de B no responde al estímulo externo. Recientemente hemos demostrado que el factor de transcripción NFAT2 es un regulador crucial de anergia en CLL. Un desafío importante en el análisis de la función de un factor de transcripción en diferentes enfermedades es la identificación de sus genes diana. Esto es de gran importancia para la elucidación de los mecanismos patogénicos y posibles intervenciones terapéuticas. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica clásica para demostrar las interacciones DNA proteína y puede, por tanto, utilizarse para identificar los genes objetivo directo de factores de transcripción en células de mamíferos. Aquí, el ChIP se utilizó para identificar LCK como gene del objetivo directo de NFAT2 en células humanas de la CLL. ADN y las proteínas asociadas son reticuladas con formaldehído y posteriormente cortado por sonicación en fragmentos de ADN de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de ADN asociados con NFAT2 son entonces selectivamente immunoprecipitated de restos celulares usando un anticuerpo αNFAT2. Después de la purificación, se detectan asociadas fragmentos de ADN mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Secuencias de ADN con evidente enriquecimiento representan regiones del genoma que están dirigidas por NFAT2 en vivo. Corte adecuado de la DNA y la selección de los anticuerpos requeridos son particularmente cruciales para la exitosa aplicación de este método. Este protocolo es ideal para la demostración de interacciones directas de NFAT2 con genes de la blanco. Su principal limitación es la dificultad para emplear viruta en ensayos a gran escala, análisis de los genes diana de múltiples factores de la transcripción en organismos intactos.
Introduction
Leucemia linfocítica crónica (CLL) representa la leucemia más común en adultos en países occidentales, exhibiendo distinta acumulación de CD19, CD23 y CD5 expresando B madura las células1. Mayoría de los pacientes presentan un curso indolente de la enfermedad, que no es necesario tratamiento específico durante muchos años. Por el contrario, algunos pacientes demuestran progresión rápida que requieren las intervenciones terapéuticas inmediatas con inmune-quimioterapia o terapias dirigidas2,3. Factor nuclear de células T activadas (NFAT) es una familia de factores de transcripción que controla varios desarrollo y procesos de activación en numerosas células tipos4,5,6. Recientemente hemos demostrado sobreexpresión y activación constitucional de NFAT2 en las células CLL de los pacientes con enfermedad indolente7. Aquí, regula un estado insensible a la estimulación de receptores de células B llamado anergia7. Para demostrar que NFAT2 se une al promotor linfocitos proteína tirosina quinasa (LCK) y regula la expresión de LCK en las células CLL humanas, un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina específicos (ChIP) fue desarrollado y empleado.
ChIP es una de las varias técnicas para investigar el papel de factores de transcripción en el gene expresión8. Expresión génica es bien orquestada de manera muy compleja por varios reguladores con factores de transcripción tomando parte insustituible en este proceso9,10,11,12. Factores de transcripción que regulan la expresión génica en un contexto espacial y temporal se han identificado en muchas especies (por ejemplo, para el desarrollo y diferenciación)13,14,15, 16,17,18. Errores en los mecanismos de control complejas que involucran factores de transcripción pueden conducir a una variedad de procesos patológicos incluyendo cáncer19,20. Por lo tanto, la identificación de factores de transcripción y sus respectivos objetivos podría ofrecer nuevas vías terapéuticas21,22. Para investigar este intrigante campo varios métodos están disponibles como ChIP, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA), varios ensayos de pull-down de ADN y ensayos reportero8,11,12, 23 , 24.
Para demostrar que un cierto factor de transcripción interactúa con regiones específicas del genoma en vivo, ChIP es una técnica ideal25. Para ello, ADN y proteínas asociadas en las células vivas son reticuladas utilizando radiación UV o formaldehído (ChIP reticulado, XChIP). Este paso se omite para obtener ADN mejor y la recuperación de proteína en el supuesto nativo ChIP (NChIP)26. Posteriormente, los complejos DNA-proteína se esquilan por sonicación en fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (PB) y immunoprecipitated de la ruina de la célula usando un anticuerpo específico contra el factor de transcripción de interés. Los fragmentos de ADN asociados son entonces purificados y caracterizados por PCR, clonación molecular y secuenciación. Técnicas alternativas utilizan micromatrices (ChIP-on-Chip) o la secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq) para analizar la immunoprecipitated ADN.
ChIP fue introducido por Gilmour y Lis en 1984 cuando utilizan UV de luz al ADN de reticulación covalente y enlazado a proteínas en la vida de las bacterias27. Lisis celular y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, se utilizaron sondas específicas de genes conocidos para mapear la distribución en vivo y la densidad de la ARN polimerasa. El método fue utilizado posteriormente por los mismos investigadores a analizar la distribución de la eucariota ARN polimerasa II en genes de proteínas de choque térmico en Drosophila28. El ensayo XChIP fue perfeccionado por Varshavsky y compañeros de trabajo que utilizan por primera vez formaldehído Cross-linking para estudiar la Asociación de la histona H4 con calor choque proteína genes29,30. El enfoque NChIP, que lleva la ventaja de una mejor recuperación de DNA y proteínas debido a epitopos naturalmente intacto y, por lo tanto, una mayor especificidad de anticuerpo, primero fue descrito por Hebbes y colegas en 198831.
La ventaja del ChIP en comparación con otras técnicas para analizar las interacciones DNA-proteína es en realidad, que la interacción real de un factor de transcripción puede ser investigado en vivo y sin sondas o condiciones artificiales creadas por tampones o geles son empleado8,11,12. Mediante la combinación de ChIP con secuenciación de próxima generación, pueden identificarse múltiples objetivos simultáneamente.
Principales limitaciones de esta técnica son su limitada aplicabilidad a los ensayos a gran escala en organismos intactos25. El análisis de patrones de expresión génica diferencial también pueden ser difícil usando técnicas de ChIP si las proteínas respectivas se expresan sólo en niveles bajos o durante las ventanas de tiempo estrecho. Otro factor potencialmente limitante es la disponibilidad de un anticuerpo apropiado para ChIP11.
El protocolo ChIP presentado aquí puede ser empleado para la identificación en vivo de genes diana de un factor de transcripción por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Específicamente, el objetivo era identificar los genes de la nueva diana de NFAT2 en CLL. ChIP fue elegido debido a su potencial para demostrar directamente el enlace de NFAT2 a las regiones promotoras de genes diferentes en condiciones naturales en células humanas del paciente CLL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos de realizar un exitoso análisis de ChIP son la selección de un anticuerpo apropiado y la optimización de la cromatina corte proceso25. La selección de los anticuerpos αNFAT2 demostrado para ser especialmente difícil durante el desarrollo de este protocolo. Aunque existen varios anticuerpos de αNFAT2 disponibles en el mercado y la mayoría de estos funciona bien para western blot y otras aplicaciones, 7A6 clon fue el único anticuerpo que podría utilizarse con éxito par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el DFG concesión MU 3340/1-1 y el Deutsche Krebshilfe conceden 111134 (ambos a MRM). Agradecemos a Elke Malenke excelente asistencia técnica).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Riferimenti
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