En kromatin Immunoprecipitation analysen identifiera roman NFAT2 målgener i kronisk lymfatisk leukemi
Summary
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) är den vanligaste leukemi i västvärlden. NFAT transkriptionsfaktorer är viktiga regulatorer av utveckling och aktivering i många celltyper. Här presenterar vi ett protokoll för användning av kromatin immunoprecipitation (ChIP) i mänskliga KLL celler att identifiera nya målgener av NFAT2.
Abstract
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) kännetecknas av utbyggnaden av maligna B cell kloner och representerar de vanligaste leukemi i västvärlden. Majoriteten av patienter med KLL visar en indolent kurs av sjukdomen samt en anergic fenotyp av sin leukemiceller, hänvisar till en B-cell receptor okänslig för yttre stimulering. Vi har nyligen visat att den Transkriptionfaktorn NFAT2 är en viktig regulator av anergi i KLL. En stor utmaning i analysen av rollen av en transkriptionsfaktor i olika sjukdomar är identifiering av dess specifika målgener. Detta är av stor betydelse för förtydligandet av patogenetiska mekanismer och potentiella terapeutiska interventioner. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en klassisk teknik att demonstrera protein-DNA interaktioner och kan därför användas för att identifiera direkta målgener av transkriptionsfaktorer i däggdjursceller. Här användes ChIP att identifiera LCK som en direkt mål gen av NFAT2 i mänskliga KLL-celler. DNA och associerade proteiner tvärbunden med formaldehyd och därefter klippt av ultraljudsbehandling i DNA fragment av ca 200-500 baspar (bp). Tvärbunden DNA-fragment som är associerad med NFAT2 är sedan selektivt immunoprecipitated från cellfragment som använder en αNFAT2 antikropp. Efter rening upptäcks associerade DNA-fragmenten via kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydlig anrikning representerar regioner i genomet som är målriktade genom NFAT2 in-vivo. Lämpliga klippning av DNA och val av krävs antikroppen är särskilt avgörande för en framgångsrik tillämpning av denna metod. Detta protokoll är idealisk för demonstration av direkta interaktioner mellan NFAT2 och målgener. Dess största begränsningen är svårigheten att anställa ChIP i storskaliga analyser analysera mål generna av flera transkriptionsfaktorer i hela organismer.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) representerar de vanligaste leukemi hos vuxna i västvärlden, uppvisar distinkta ansamling av CD19, CD23 och CD5 uttrycker mogna B-celler1. De flesta patienter uppvisar en indolent sjukdom kurs, vilket inte nödvändiggör särskild behandling under många år. Däremot uppvisar vissa patienter snabb progression som kräver omedelbar terapeutiska interventioner med immun-kemoterapi eller andra riktade terapier2,3. Nukleär faktor av aktiverade T-celler (NFAT) är en familj av transkriptionsfaktorer som styr olika utvecklings och aktivering processer i många cell typer4,5,6. Vi visade nyligen överuttryck och konstitutionella aktiveringen av NFAT2 i KLL celler från patienter med indolent sjukdom7. Det reglerar här, ett tillstånd som inte svarar på B-cell receptorn stimulering kallas anergi7. För att visa att NFAT2 binder till promotorn lymfocyter-specifika protein tyrosine kinase (LCK) och reglerar LCK uttryck i mänskliga KLL celler, en specifik kromatin immunoprecipitation assay (ChIP) utvecklades och anställd.
ChIP är en av de flera teknikerna för att undersöka betydelsen av transkriptionsfaktorer i gen uttryck8. Genuttryck är tätt iscensatt i ett mycket komplext sätt av flera tillsynsmyndigheter med transkriptionsfaktorer som en oersättlig del i denna process9,10,11,12. Transkriptionsfaktorer som reglerar genuttrycket i rumsliga och tidsmässiga sammanhang har identifierats i talrika arter (t.ex. för utveckling och differentiering)13,14,15, 16,17,18. Fel i intrikata kontrollmekanismer som involverar transkriptionsfaktorer kan leda till en mängd olika patologiska processer inklusive cancer19,20. Identifiering av transkriptionsfaktorer och deras respektive mål kan därför erbjuda nya terapeutiska möjligheter21,22. För att undersöka detta spännande område finns flera metoder som ChIP, elektroforetiska mobilitet Skift assay (EMSA), olika DNA nedrullningsbara analyser och reporter-analyser8,11,12, 23 , 24.
För att visa att en viss transkriptionsfaktor interagerar med specifika regioner i genomet är in vivo ChIP en idealisk teknik25. För detta ändamål, är DNA och associerade proteiner i levande celler tvärbunden med hjälp av UV-bestrålning eller formaldehyd (tvärbunden ChIP, XChIP). Detta steg utelämnas att erhålla bättre DNA och protein återhämtning i den så kallade infödda ChIP (NChIP)26. De DNA-proteinkomplex är därefter klippt av ultraljudsbehandling i fragment av ca 200-500 baspar (bp) och immunoprecipitated från de cellfragment som använder en specifik antikropp mot Transkriptionfaktorn av intresse. De associerade DNA-fragment därefter renas och kännetecknas av PCR, molekylär kloning och sekvensering. Alternativa tekniker använda microarrays (ChIP-on-Chip) eller nästa generations sekvensering (ChIP-Seq) för att analysera immunoprecipitated DNA.
ChIP introducerades först av Gilmour och Lis 1984 när de använde UV ljus kovalent korslänk DNA och bundna proteiner i levande bakterier27. Vid cell lysis och immunoprecipitation bakteriell RNA-polymeras användes särskilda sonder av kända generna att mappa in-vivo distribution och täthet av RNA-polymeras. Metoden användes senare av samma utredarna för att analysera fördelningen av eukaryota RNA-polymeras II på heat shock protein gener i Drosophila28. XChIP analysens förfinades ytterligare av Varshavsky och medarbetare som först används formaldehyd tvärbindningsmedel för att studera associering av Histon H4 med heat shock protein gener29,30. Det NChIP synsättet, som bär fördelen med en bättre DNA och protein återhämtning beror på naturligt intakt epitoper och, därför, större antikropp specificitet, beskrevs först av Hebbes och kollegor i 198831.
Fördelen med ChIP i jämförelse med andra tekniker för att analysera DNA-protein interaktioner är i själva verket att faktiska växelverkan av en transkriptionsfaktor kan vara undersökta i vivo och ingen sonder eller konstgjorda förhållanden skapats av buffertar eller geler är anställd8,11,12. Genom att kombinera ChIP med nästa generations sekvensering, kan flera mål identifieras samtidigt.
Stora begränsningar av denna teknik är dess begränsad tillämplighet till storskaliga analyser i hela organismer25. Analysen av differentiell gen uttrycksmönster kan också vara utmanande med ChIP teknik om respektive proteinerna uttrycks endast vid låga nivåer eller under smala tidsfönster. En annan potentiellt begränsande faktor är tillgången på en lämplig antikropp lämpad för ChIP11.
Protokollet ChIP som presenteras här kan användas för identifiering i vivo av målgener av en transkriptionsfaktor av kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). Specifikt, var målet att identifiera nya målgener av NFAT2 vid KLL. ChIP valdes på grund av dess potential att direkt påvisa bindning av NFAT2 till arrangören regioner i olika målgener under naturliga förhållanden i mänskliga KLL patientens celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiska steg för att utföra en lyckad ChIP-analysen är valet av en lämplig antikropp och optimering av den kromatin klippning process25. Valet av αNFAT2 antikroppen visat sig vara särskilt utmanande under utvecklingen av detta protokoll. Medan det finns flera αNFAT2 antikroppar kommersiellt tillgänglig och majoriteten av dessa fungerar bra för western blotting och andra applikationer, var klon 7A6 den enda antikropp som kan användas framgångsrikt för ChIP7. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av DFGEN bevilja MU 3340/1-1 och den Deutsche Krebshilfe bevilja 111134 (båda tilldelas M.R.M.). Vi tackar Elke Malenke för utmärkt tekniskt bistånd).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Riferimenti
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Biologia dello sviluppo. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
