Elastische kleuring op paraffine-ingesloten Dia's van pT3N0M0 maagkanker weefsel
Summary
Hier presenteren we een protocol van elastische kleuring om elastische vezels te identificeren in pT3N0M0 maagkanker weefsels op formalin-vaste, paraffine-ingesloten secties. Vervolgens beschrijven we een methode om te bepalen of tumorcellen buiten de elastische lamina vallen.
Abstract
De elastische lamina, die zich meestal in de submesotheliale laag bevindt, grenzend aan de peritoneum mesotheliale cellen, is amfifiele op hematoxyline en eosine (H & E) kleuring, maar kan worden gevisualiseerd door middel van elastische kleuring. Een van de belangrijke voordelen van elastische kleuring is dat het gemakkelijk is om te bepalen of tumorcellen buiten de elastische lamina zijn binnengevallen. Dit helpt bij het onderzoeken van de omvang van de peritoneale oppervlakte invasie, waardoor de pT3-en pT4 stadia in gastro-intestinale kanker worden onderscheiden. In deze studie presenteren we een protocol voor het identificeren van elastische vezels in de formalin-Fixed, paraffine-ingesloten pT3N0M0 maagkanker weefsel secties. We bereiden 5-μm paraffine profielen op die op dia’s zijn bevestigd en vervolgens worden alle dia’s gedeparaffineerd en opnieuw gehydrateerd tijdens de kleurings procedure. Vervolgens worden alle secties geoxideerd door kaliumpermanganaat, gebleekt door oxaalzuur, gekleurd door elastische kleuring, en tegengekleurd door van Gieson’s. Tot slot onderzoeken we het effect van vlekken; elastische lamina is gekleurd blauw-zwart en collageenvezels zijn rood gekleurd, terwijl de kankercellen gekleurd zijn in verschillende tinten geel. We beschrijven ook in detail de methoden die worden gebruikt voor het bepalen van de positionele relatie tussen kankercellen en elastische lamina. Deze methode is eenvoudig, laag-kosten, en wijd toepasbaar in de identificatie van peritoneale oppervlakte invasie in gastro-intestinale kanker vanwege zijn uitstekende selectiviteit voor elastische vezels en authentieke resultaten.
Introduction
Volgens de tumor, node, en metastasen (TNM) kanker staging-systeem, de prognose van maagkanker op pathologisch stadium pT4 is significant slechter dan dat bij pT3 (8e UICC/AJCC)1. Bij maagkanker is de classificatie van de primaire tumor (pT) meestal afhankelijk van de diepte van de tumorinvasie2. Pathologische fase pT3 maagkanker wordt gedefinieerd als kanker binnendringt door de Muscularis propria in subserosale weefsels, overwegende dat pT4 maagkanker wordt gedefinieerd als kanker penetreren aan het oppervlak van de viscerale peritoneum. De aanwezigheid van de peritoneale oppervlakte invasiviteit is de sleutel tot het onderscheiden van de twee stadia2. Echter, omdat de peritoneale mesotheel cellaag is erg dun, het kan worden beschadigd tijdens de operatie, postoperatieve behandeling, en fixatie3. Bovendien kunnen tumor-gerelateerde inflammatoire veranderingen en fibrose de normale anatomie van het peritoneum beschadigen, waardoor het zeer moeilijk is om de peritoneale oppervlakte invasie nauwkeurig te beoordelen met alleen H & E kleuring4. Huidige aanvullende diagnosemethoden zoals cytologie en immunohistochemie zijn van beperkte diagnostische waarde5,6 omdat ze vals-positief zijn of een lage kosteneffectiviteit hebben.
Het serosale membraan omvat het peritoneum, pleura en pericardium, en bestaat uit het mesothelium, een kelder membraan en een sub-mesotheliale laag7. Een veelvoorkomend histologisch kenmerk van het serosale membraan is de aanwezigheid van een elastische lamina in de submesotheliale laag, grenzend aan de mesotheliale cellen8,9. Elastische lamina heeft een sterk anti-schadelijk vermogen en kan dienen als een alternatieve prognostische marker als de mesotheliale cellen worden vernietigd door ernstige tumor-gerelateerde ontsteking of fibrose3. Elastische lamina bestaat voornamelijk uit elastine en microfibril10, die kunnen worden gevisualiseerd door elastische kleuring. De belangrijkste reden achter het gebruik van de elastische kleuring is dat de elastine een waterstof binding vormt met de fenolische groep resorcinol in de elastineoplossing, waardoor elastische vezels blauw-zwart worden gekleurd. Na van gieson (VG) contrasterende kleuring, kunnen collageenvezels rood worden gekleurd en spiervezels en rode bloedcellen kunnen geel worden gekleurd8,11,12,13.
De achtste editie van de TNM fasering van longkanker definieert viscerale pleurale invasie (T2) als een tumorinvasie voorbij de elastische lamina of een invasie aan het oppervlak van de viscerale borstvlies2. Studies over colorectale kanker hebben aangetoond dat de elastische lamina-invasie in pT3 colorectale kanker de oorzaak kan zijn van slechte prognoses. De 5-jarige ziektevrije en totale overlevings snelheid van colorectale kanker is ook bewezen als pT4a13,14,15. Op basis van onze eerdere studies over elastische kleuring is gebleken dat de invasie van elastische lamina een significante negatieve invloed heeft op de prognose van pT3 maagkanker en op dezelfde manier moet worden behandeld als pT4a maagkanker12. Vandaar dat deze eenvoudige en kosteneffectieve methode kan helpen bij het elimineren van onzekerheid in de resultaten verkregen door H & E kleuring, en andere gemeenschappelijke beperkingen in verband met andere hulp diagnosemethoden, waaronder cytologie en immunohistochemie, onder Anderen. Deze methode kan efficiënt worden gebruikt voor het diagnosticeren van peritoneale oppervlakte invasies van gastro-intestinale kanker, vooral in sommige dubbelzinnige gevallen. Het is handig omdat H & E vlek en andere vlekken meestal het moeilijk maken om dergelijke invasies te identificeren. Deze methode zorgt ook voor een betrouwbaarheid van de resultaten, omdat het zeer selectief, met name voor elastische vezels. Hier voeren we elastische kleuring uit om te bepalen of tumorcellen de elastische lamina hebben binnengevallen in pT3N0M0 maagkanker12.
Deze methode wordt gebruikt voor het identificeren van elastische vezels in weefsels op formaline-vaste, paraffine-ingesloten secties, en kan ook worden gebruikt voor bevroren secties. Hier kiezen we voor paraffine-embedded secties voor het beste onderhoud van cellulaire en weefsel morfologie. Alle stappen in dit protocol vinden plaats op kamertemperatuur. Een commerciële kleurings Kit met een kaliumpermanganaatoplossing, een oxaalzuur oplossing, een elastine-oplossing en een van Gieson-oplossing wordt gebruikt in de gepresenteerde studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode die hier wordt voorgesteld, biedt een nauwkeurige benadering voor het identificeren van de subserosale elastische lamina. De methode kan worden gebruikt om te evalueren of tumorcellen de elastische lamina hebben binnengevallen in pT3N0M0 maagkanker12. Elastische lamina is roodachtig in H & E-gekleurd secties, die niet gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van collageenvezels, en andere bestaande hulp diagnosemethoden, zoals cytologie en immunohistochemie, hebben ook een beperkte dia…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de steun gedeeltelijk van de National Natural Science Foundation (NO. 81401902 en NO. 81501992) en de Hunan Natural Science Foundation (NO. 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). Het manuscript is geschreven door Guang lei. Het hele experiment wordt uitgevoerd door Guang lei en Haiyan Yang. De auteurs bedanken de hulp van pathologen en van Fellows die de gegevens van patiënten opvolgen.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
Riferimenti
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N., Mills, S. E. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. , 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin–a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert’s resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
