Kracht-Clamp reometrie voor het karakteriseren van de Hydrogels op basis van eiwitten

Summary

Een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek wordt gebruikt voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van laag-volume op basis van eiwitten hydrogel monsters aangebonden tussen een spreekspoel motor en een kracht sensor. Een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem zorgt voor het ‘klemmen’ van de kracht ervaren om het gewenste protocol.

Abstract

Hier beschrijven we een kracht-clamp reometrie methode karakteriseren de biomechanische eigenschappen van hydrogels op basis van eiwitten. Deze methode maakt gebruik van een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem toe te passen gecontroleerde-force protocollen op cilindrische op basis van eiwitten hydrogel monsters, die tussen een lineaire spreekspoel-motor en een transducer kracht worden aangebonden. Tijdens het uitvoeren van past de PID-systeem de extensie van het monster hydrogel te volgen van een vooraf gedefinieerde kracht-protocol door het minimaliseren van het verschil tussen de gemeten en instelpunt krachten. Deze unieke benadering op basis van eiwitten hydrogels kunt het binden van extreem laag-volume hydrogel monsters (< 5 µL) met verschillende eiwit concentratie. Onder force-oprit protocollen, waar de toegepaste stress verhoogt en verlaagt lineair met de tijd, het systeem maakt de studie van de elasticiteit en hysteresis gedragingen die zijn gekoppeld aan de (un) vouwing van eiwitten en het meten van standaard elastische en Visco parameters. Onder constante-force, waar de kracht pulse een stap-achtige vorm, de elastische reactie, behoren tot de verandering in werking is getreden heeft, is ontkoppeld van de visco-reactie, die afkomstig is van eiwit domein ontvouwen en uiteinde. Vanwege de geringe hoeveelheden monster en veelzijdigheid bij de toepassing van verschillende mechanische verstoringen, is kracht-clamp reometrie geoptimaliseerd voor het onderzoeken van de mechanische reactie van eiwitten onder kracht met behulp van een bulk-aanpak.

Introduction

Afgezien van een unieke fysieke eigenschappen, houdt op basis van eiwitten hydrogels de belofte van een revolutie in kracht spectroscopie doordat de meting van verschillende miljard moleculen in een ‘trekken’, waardoor de studie van eiwitten in drukke omgevingen, vergelijkbaar zijn met die gevonden in de huid en andere weefsels. Eiwit domeinen blijven gevouwen binnen hydrogels, waardoor de studie van hun biomechanische reactie te dwingen, bindende partners, en chemische voorwaarden. Bovendien lijkt de biomechanische reactie van eiwit domeinen binnen hydrogels op het antwoord gezien met single-molecuul kracht spectroscopie technieken. Bijvoorbeeld chemische denatureringsmiddelen en oxiderende agenten het verkleinen van de stabiliteit van de gevouwen staat, zowel op de interne eiwit domein niveau^1,2,3 de macroscopische niveau^{4,5 , 6 , 7}. ook osmolytes verhogen de stabiliteit van enkele eiwitten^8,9, wat leidt tot een afname van de visco-reactie van de hydrogels, voor hetzelfde force voorwaarden^7,10.

Verschillende benaderingen zijn gelegd om te synthetiseren op basis van eiwitten hydrogels, hetzij door met behulp van de fysieke interacties^11,12 of covalente cross-linking^4,13. Covalente Reacties toestaan voor vaste cross-linking locaties en deze hydrogels kan het herstellen van de oorspronkelijke toestand na een verwijdering van de mechanische of chemische verstoringen. Een succesvolle aanpak voor covalente dwarsbinding, is afhankelijk van de vorming van covalente koolstof-koolstof bindingen tussen blootgestelde tyrosine aminozuren met ammonium persulfate (APS) als de oxidator en een ruthenium (II)-zout als een initiatiefnemer (Figuur 1)¹⁴. Bij blootstelling aan wit licht, kan een oplossing van geconcentreerde eiwitten worden omgezet in een hydrogel. Door het beheersen van wanneer de reactie begint, de eiwit-APS-mix kunnen worden geïnjecteerd in elke vorm van gieten, waardoor zoals polytetrafluorethyleen (PFTE) buizen (figuur 1B en 1 C), het gebruik van een uiterst kleine oplossing volume¹⁵. Bovendien, het gebruik van wit licht om te activeren van de cross-linking reactie resulteert in een beperkte bleken van fluorescente proteïnen en staat de formulering van samengestelde hydrogels met een fluorescente markeringen (Figuur 1). Andere methoden van de vorming op basis van eiwitten hydrogel gebruiken dwarsbinding op basis van de SpyTag-SpyCatcher covalente interactie¹⁶, amine cross-linking via Glutaaraldehyde¹³of¹⁷interacties biotine-daar.

Dynamische mechanische analyse (DMA) is momenteel een techniek die op grote schaal gebruikt om te studeren polymeer gebaseerde hydrogels^13,18. Terwijl DMA biomaterialen constante kracht protocollen toepassen kunt, vereist het Youngs moduli over 10 kPa en grote steekproef volumes van meer dan 200 µL¹⁹. Vanwege deze beperkingen zijn eiwit hydrogels over het algemeen te zacht om door deze techniek worden onderzocht. Zoals gemanipuleerde polyproteins moeilijker zijn te synthetiseren dan polymeren, aangezien zij een levend systeem vereisen te produceren, zijn dergelijke hoge volumes inefficiënt, bij de beste^4,15. Bovendien zijn de meeste biologische weefsels zachter dan 10 kPa. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld voor biologische monsters, vooral in de studie van^20,21van de elasticiteit van de spieren. Deze technieken kunnen ook opereren onder feedback aan constante kracht maar zijn geoptimaliseerd voor monsters met kleine diameters (in de range van micron) blootgesteld om af te dwingen voor zeer korte tijd (meestal minder dan 1 s).

Op basis van eiwitten hydrogels werden met succes bestudeerd met gemodificeerde reometrie technieken. Bijvoorbeeld, maakt de hydrogel gieten in een ring vorm het gebruik van extensionele reometrie voor het meten van de verandering in de ervaren kracht als een functie van uitbreiding^4,22. Andere benaderingen voor het bestuderen van de reologische eigenschappen van eiwitten gebaseerde hydrogels gecontroleerde schuifspanning reometrie gebruiken Deze technieken kunnen ook laag monstervolume bereiken en tolereren van zachte materialen. Echter, deze methoden ontbreken de mogelijkheid om na te bootsen de trekken krachten die oorzaak eiwit ontvouwen in vivoen Youngs modulus wordt berekend op basis van complexe theorieën waarvoor verschillende veronderstellingen en correcties²³.

We hebben onlangs gemeld dat een nieuwe aanpak die gebruikmaakt van een kleine hoeveelheid eiwitten, polymeervorm binnen de buizen met een diameter < 1 mm. Onze eerste implementatie van deze techniek was in de lengte-clamp modus, waarin de gel werd uitgebreid naar aanleiding van de gewenste protocol¹⁵actief. Bij deze methode wordt ervaring de eiwitten een voortdurende veranderingen in zowel de uitbreiding als de kracht terwijl de domeinen ontvouwen, waardoor de data interpretatie omslachtig. Onlangs hebben we een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek, waar een feedback-lus laag-volume eiwit hydrogels naar een vooraf gedefinieerde geldende protocol⁷ (Figuur 2 blootstellen kan) gemeld. Een analoog PID systeem vergelijkt de kracht gemeten door de kracht sensor met de punt van de reeks verzonden vanaf de computer en past de gel-extensie door het bewegen van de spreekspoel om te minimaliseren van het verschil tussen de twee ingangen. Deze ‘klemmen’ van de kracht staat nu voor nieuwe soorten experimenten voor het meten van de biomechanica van eiwit hydrogels.

In de modus kracht-oprit ervaringen een getuide eiwit hydrogel een constante stijging en daling van kracht met de tijd. De PID compenseert voor eventuele visco vervorming door de extensie te wijzigen in een niet-lineaire manier, afhankelijk van het soort eiwit en hydrogel formulering. Het belangrijkste voordeel van kracht helling is dat het mogelijk maakt de kwantificering van standaardparameters, zoals Youngs modulus en energie dissipatie, als gevolg van een ontvouwen en uiteinde van eiwit domeinen.

In constante-force-modus, de toegepaste kracht verandert in een stap-achtige manier. In deze modus, de gel uitbreidt en contracten elastisch wanneer de kracht is verhoogd of verlaagd, respectievelijk, gevolgd door een tijd-afhankelijke vervorming. Deze visco vervorming, plaatsvindt terwijl de gel een constante kracht ervaringen, is direct gerelateerd aan het domein ontvouwen/uiteinde. Op een vereenvoudigde manier, kan deze uitbreiding worden gezien als het equivalent van verschillende miljard enkel molecuul sporen samen gemiddeld en allemaal tegelijk gemeten. Constante-force protocollen kunnen worden gebruikt om de kruip en ontspanning van eiwit hydrogels als een functie van kracht en tijd te studeren. Als een functie van kracht, voor BSA gebaseerde eiwit hydrogels, hebben we onlangs aangetoond dat er een lineaire afhankelijkheid tussen de elastiek en visco uitbreiding en de terugslag met de toegepaste spanning⁷.

Hier detail wij de werking van een kracht-clamp-rheometer met behulp van samengestelde gels gemaakt van een mengsel van eiwit L (8 domeinen²⁴, afgebeeld als L₈) en een eiwit L-eGFP construct (L-eGFP), waardoor de algehele hydrogel TL en gebruiksvriendelijke aantonen.

Protocol

1. reagentia oplossing voorbereiding Bereid een startende eiwit-oplossing door ontbinding/verdunnen van de proteïne van belang zijn voor de gewenste concentratie, met behulp van een Tris-buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane en 150 mM NaCl, pH 7.4].Opmerking: De kleinste eiwitconcentratie voor die cross-linking leidt tot hydrogels hangt af van het eiwit gebruikt en is meestal > 1 mM. Bereiden van voorraden van ammoniumnitraat persulfate (APS) (1 M) en tris(bipyridine)ruthenium(II) chlor…

Representative Results

Figuur 1A blijkt de regeling van de photoactive reactie die gebruikt voor het synthetiseren van de L-EGP/L8 hydrogel. Figuur 1B toont de hydrogel mengsel in de PTFE-buis vóór en na de photoactivation. Figuur 1 c presenteert de geëxtrudeerde L-eGFP-L8 hydrogel binnen een oplossing van Tris. De hydrogel monster heeft geen structurele gebreken zoals inkepingen. Hydrogels met dui…

Discussion

Hierin beschrijven we een kracht-clamp reometrie techniek om te onderzoeken van de biomechanische reactie van laag-volume op basis van eiwitten hydrogels. Bovendien, is een protocol bedoeld voor het synthetiseren van een uniforme cilindrische laag-volume hydrogel eiwitSteekproef. Een protocol wordt ook gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe u verschillende soorten eiwit gebaseerde hydrogels met de elasticiteit van de diverse binden zonder mechanische vervorming en de eventuele schade aan op basis van eiwitten hydrogel…

Materials

SI-KG4A force transducer	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor	Equipement Solutions	LFA2010
Bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip	BD	309628
Silane, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll	Cole-Parmer	EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge	Healthcare Supply Pros	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp	ALB	USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.