Rhéométrie force-pince pour caractériser les Hydrogels à base de protéines

Summary

Une nouvelle technique de rhéométrie pince-force est utilisée pour étudier les propriétés mécaniques des échantillons d’hydrogel basées sur les protéines de faible volume attachés entre un moteur de la bobine et un capteur de force. Un analogique proportionnel-intégral-dérivé (PID) système permet le « serrage » de la force subie au protocole désiré.

Abstract

Nous décrivons ici une méthode de rhéométrie force-pince pour caractériser les propriétés biomécaniques des hydrogels à base de protéines. Cette méthode utilise un système analogique de (PID) proportionnel-intégral-dérivé pour appliquer des protocoles contrôlés-force sur des échantillons cylindriques hydrogel basées sur les protéines, qui sont attachés au maximum entre un moteur bobine linéaire et un capteur de force. Au cours de l’opération, le système PID ajuste l’extension de l’échantillon d’hydrogel à suivre un protocole prédéfini force en réduisant au minimum la différence entre les forces mesurées et consigne. Cette approche unique à base de protéines hydrogels permet l’attachement des échantillons de très faible volume hydrogel (< 5 µL) avec des concentrations de protéines différentes. En vertu de protocoles de force-rampe, où la contrainte appliquée augmente et diminue de façon linéaire avec le temps, le système permet l’étude des comportements élasticité et hystérésis associé le (dé) pliage des protéines et la mesure de l’élastique standard et paramètres de visco-élastique. En vertu de la force constante, où la pulsation a une étape-comme la forme, la réponse élastique, dû au changement de force, est découplé de la réponse viscoélastique, qui vient du domaine protéique déplier et replier. En raison de son faible volume échantillon et la polyvalence dans l’application de diverses perturbations mécaniques, pince-force rhéométrie est optimisé afin d’étudier la réponse mécanique des protéines sous la force à l’aide d’une approche en vrac.

Introduction

En dehors d’avoir des propriétés physiques uniques, basées sur les protéines hydrogels promettent de révolutionner la spectroscopie de force en permettant la mesure de plusieurs milliards de molécules dans un « pull », permettant ainsi à l’étude des protéines dans des environnements surpeuplés, similaires à celles rencontrées dans la peau et autres tissus. Domaines protéiques restent pliés à l’intérieur des hydrogels, permettant l’étude de leur réaction biomécanique pour forcer, contraignant les partenaires et les conditions chimiques. En outre, la réaction biomécanique des domaines protéiques à l’intérieur des hydrogels ressemble à la réponse vue avec force de molécules simples techniques de spectroscopie. Par exemple, la liste des dénaturants chimiques et agents oxydants diminuent la stabilité de l’état plié, la seule protéine domaine niveau^1,2,3 tant le macroscopique niveau^{4,5 , 6 , 7}. de même, osmolytes augmenter la stabilité des protéines simples^8,9, conduisant à une diminution de la réponse viscoélastique d’hydrogels, pour la même force conditions^7,10.

Plusieurs approches ont été appliquées pour synthétiser des hydrogels à base de protéines, soit à l’aide d’interactions physiques^11,12 ou covalente réticulation^4,13. Covalentes réactions permettent des emplacements fixes de réticulation et ces hydrogels peut récupérer l’état initial après une suppression des perturbations mécaniques ou chimiques. Une approche réussie de réticulation covalente s’appuie sur la formation de liaisons covalentes carbone-carbone entre des acides aminés tyrosine exposés en utilisant le persulfate d’ammonium (APS) comme un oxydant et un sel de ruthénium (II) comme un initiateur (Figure 1)¹⁴. Lors de l’exposition à la lumière blanche, une solution de protéines concentrées peut être transformée en un hydrogel. En contrôlant lorsque la réaction commence, le mélange de protéine-APS peut être injectée dans toute forme de coulée, comme le polytétrafluoroéthylène (PTFE) tubes (Figure 1 b et 1C), permettant l’utilisation d’une solution extrêmement petit volume¹⁵. En outre, l’utilisation de la lumière blanche pour déclencher la réaction de réticulation entraîne un blanchiment limitée de protéines fluorescentes et permet la formulation d’hydrogels composites avec des marqueurs fluorescents (Figure 1). Autres méthodes de formation axée sur les protéines hydrogel utilisent réticulation basé sur le SpyTag-SpyCatcher interaction covalente¹⁶, amine réticulation par glutaraldéhyde¹³ou streptavidine-biotine interactions¹⁷.

Analyse mécanique dynamique (DMA) est actuellement une technique largement utilisée pour étudier à base de polymères hydrogels^13,18. Tandis que DMA peut appliquer des protocoles de force constante aux biomatériaux, requiere modules de Young sur 10 kPa et volumes grand échantillon de plus de 200 µL¹⁹. En raison de ces limitations, hydrogels de protéine sont généralement trop faible pour être étudiés par cette technique. Car les polyprotéines machinés sont difficiles à synthétiser que polymères, car ils nécessitent un système vivant pour produire, ces grands volumes sont inefficaces, à meilleur^4,15. En outre, la plupart des tissus biologiques sont plus douces que 10 kPa. Plusieurs approches ont été développées pour des échantillons biologiques, en particulier dans l’étude du muscle élasticité^20,21. Ces techniques peuvent fonctionner également sous vos commentaires d’employer la force constante mais sont optimisés pour des échantillons de petit diamètre (de l’ordre du micron) exposés à la force pour des temps très courts (généralement inférieure à 1 s).

Hydrogels à base de protéines ont été étudiées avec succès avec des techniques modifiées rhéométrie. Par exemple, exprimer l’hydrogel dans une forme d’anneau permet l’utilisation de distension rhéométrie pour mesurer le changement dans l’équipe expérimenté en fonction de l’extension^4,22. Autres approches pour étudier les propriétés rhéologiques des hydrogels à base de protéines utilisent rhéométrie contrôlé-la contrainte de cisaillement. Ces techniques peuvent également atteindre le volume de l’échantillon faible et tolérer les matériaux tendres. Cependant, ces méthodes manque la capacité à imiter le tirant force cette cause protéiques qui se déroule en vivoet module de Young est calculée en fonction des théories complexes qui nécessitent des hypothèses et corrections diverses²³.

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche qui utilise une petite quantité de protéines, polymérisé à l’intérieur des tubes d’un diamètre < 1 mm. Notre première mise en œuvre de cette technique fonctionnait en mode collier en longueur, où le gel a été prolongé après le protocole désiré¹⁵. Dans cette méthode, les protéines éprouver un changement continu en extension et en force tandis que les domaines se déroulent, rendant l’interprétation des données encombrantes. Récemment, nous avons rapporté une nouvelle technique de rhéométrie pince-force, où une boucle de rétroaction peut exposer des hydrogels de protéine de faible volume à une force prédéfinies protocole no⁷ (Figure 2). Un système PID analogique compare la force mesurée par le capteur de force avec le point de consigne envoyé depuis l’ordinateur et permet d’ajuster l’extension du gel en déplaçant la bobine pour réduire au minimum la différence entre les deux entrées. Ce « bridage » de la force permet maintenant de nouveaux types d’expériences pour mesurer la biomécanique des hydrogels de protéine.

En mode force-rampe, un hydrogel de protéine captif connaît une augmentation constante et la diminution de la force avec le temps. Le PID compense toute déformation viscoélastique en changeant l’extension d’une manière non linéaire, selon le type de formulation de protéine et hydrogel. Le principal avantage de la rampe de la force, c’est qu’il permet la quantification des paramètres standards, tels que le module de Young et de dissipation de l’énergie, en raison d’un déploiement et le repliement de domaines protéiques.

En mode force constante, la force appliquée change dans une étape-comme la mode. Dans ce mode, le gel se prolonge et contrats élastiquement quand la force est augmentée ou diminuée, respectivement, suivie d’une déformation en fonction du temps. Cette déformation viscoélastique, qui aura lieu alors que le gel subit une force constante, est directement liée au domaine de dépliement/repliement. De façon simplifiée, cette extension peut être vu comme l’équivalent de plusieurs traces de molécules simples milliards en moyenne ensemble et mesurée à la fois. Force constante protocoles peuvent être utilisés pour étudier le fluage et relaxation des hydrogels de protéines en fonction de la force et l’heure. En fonction de la force, pour la protéine axée sur les BSA hydrogels, nous avons montré récemment qu’il y a une dépendance linéaire entre l’extension élastique et viscoélastique et recul avec la souche appliquée⁷.

Ici, nous détaillons le fonctionnement d’un rhéomètre de force-pince en utilisant des gels composites fabriqués à partir d’un mélange de protéines L (8 domaines²⁴, dépeinte comme L₈) et une construction de protéine L-eGFP (L-eGFP), ce qui rend l’hydrogel globale fluorescent et facile à démontrer.

Protocol

1. préparation de la Solution réactifs Préparer une solution de protéine départ en dissolvant/diluant de la protéine d’intérêt de la concentration désirée, à l’aide d’un tampon Tris [tris (hydroxyméthyl) aminométhane de 20 mM et 150 mM NaCl, pH 7.4].NOTE : La plus petite concentration de protéines de réticulation menant à hydrogels dépend de la protéine utilisée et est généralement > 1 mM. Préparer des stocks de persulfate d’ammonium (APS) (1 M) et le chlorure de tri…

Representative Results

Figure 1 a montre le schéma de la réaction photoactif utilisée pour synthétiser l’hydrogel de8 L-EGP/L. Figure 1 b montre le mélange hydrogel dans le tube PTFE, avant et après la photoactivation. La figure 1 présente l’hydrogel de8 L-eGFP-l extrudé à l’intérieur d’une solution de Tris. L’exemple de l’hydrogel n’a aucun défauts structuraux tels que les en…

Discussion

Ici, nous décrivons une technique de rhéométrie force-clamp pour étudier la réaction biomécanique des hydrogels basées sur les protéines de faible volume. De plus, un protocole est fourni pour synthétiser un échantillon d’hydrogel de protéine de faible volume cylindrique uniforme. Un protocole est également présenté qui décrit comment attacher les différents types d’hydrogels base de protéines avec des élasticités différentes sans provoquer des déformations mécaniques ou des dommages pour les é…

Materials

SI-KG4A force transducer	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor	Equipement Solutions	LFA2010
Bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip	BD	309628
Silane, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll	Cole-Parmer	EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge	Healthcare Supply Pros	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp	ALB	USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.