Kraft-Clamp reometri för kännetecknar proteinbaserade Hydrogels
Summary
En ny kraft-clamp reometri teknik används för att undersöka de mekaniska egenskaperna av låg volym proteinbaserade hydrogel prover uppbundna mellan en voice-coil motor och en kraftsensor. En analog proportionell-integral-derivat (PID) system möjliggör den ‘fastspänning’ av kraften som är erfarna att önskade protokoll.
Abstract
Här, beskriver vi en kraft-clamp reometri metod för att karakterisera proteinbaserade hydrogels biomekaniska egenskaper. Denna metod använder en analog proportionell-integral-derivat (PID) system för att applicera kontrollerade-force protokoll på cylindriska proteinbaserade hydrogel prover, vilket är uppbundna mellan en linjär röst-coil motor och en kraftgivare. Under drift justeras PID förlängning av hydrogel provet att följa en fördefinierad kraft-protokollet genom att minimera skillnaden mellan uppmätta och inställt krafter. Denna unika metod att protein-baserade hydrogels kan den tjudra av extremt låg volym hydrogel prover (< 5 µL) med olika protein koncentrationer. Under kraft-ramp protokoll, där tillämpad stressen ökar och minskar linjärt med tiden, systemet möjliggör studiet av elasticitet och hysteres beteenden associerade med (FN) vikningen av proteiner och mätning av standard elastisk och viskoelastiska parametrar. Under konstant-kraft, där kraft puls har en steg-liknande form, elastisk svaret, på grund att förändringen i kraft, är frikopplad från det viskoelastiska svar, som kommer från protein domän utspelar sig och vika. På grund av dess låg volym prov och mångsidighet i att tillämpa olika mekaniska störningar, är kraft-clamp reometri optimerad för att undersöka den mekaniska Svaren av proteiner under kraft med en bulk-metod.
Introduction
Förutom att ha unika fysiska egenskaper, håller proteinbaserade hydrogeler löftet om revolutionerar kraft spektroskopi genom att möjliggöra mätning av flera miljarder molekyler i en ‘dra’, vilket möjliggör studier av proteiner i trånga miljöer, liknar de stött på i huden och andra vävnader. Protein domäner förbli vikta inuti hydrogels, möjliggör studier av deras biomekaniska svar att tvinga, bindande partners, och kemiskt villkorar. Dessutom liknar protein domäner släpper hydrogels biomekaniska svar svar ses med singel-molekyl kraft spektroskopi tekniker. Exempelvis minskar kemiska denatureringsmedel och oxiderande ämnen stabiliteten i vikta staten, både på den enda protein domän nivåerna1,2,3 och på makroskopisk nivå4,5 , 6 , 7. på samma sätt osmolytes öka stabiliteten i enstaka proteiner8,9, leder till en minskning av viskoelastiska svar hydrogels, för samma kraft villkor7,10.
Flera metoder har genomförts för att syntetisera protein-baserade hydrogels, genom att antingen använda fysiska interaktioner11,12 eller kovalent tvärbindande4,13. Kovalent reaktioner möjliggöra fasta tvärbindande platser och dessa hydrogels kan återställa det ursprungliga tillståndet vid en borttagning av de mekaniska eller kemiska störningar. En framgångsrik strategi för kovalent cross-linking beroende bildar kovalenta kol-kol bindningar mellan exponerade tyrosin aminosyror med ammonium persulfatoxidation (APS) som en antioxidant och en rutenium (II) salt som en initiativtagare (figur 1)14. Vid exponering för vitt ljus, kan en lösning av koncentrerade proteiner förvandlas till en hydrogel. Genom att kontrollera när den reaktion börjar, protein-APS mixen kan injiceras i gjutning form, medger såsom polytetrafluoreten (PFTE) rör (figur 1B och 1 C), användning av en extremt liten lösning volym15. Dessutom användningen av vitt ljus att utlösa tvärbindande reaktionen resulterar i en begränsad blekning av fluorescerande proteiner och tillåter formuleringen av sammansatta hydrogels med fluorescerande markörer (figur 1). Andra protein-baserade hydrogel bildandet metoder använder cross-linking baserat på SpyTag-SpyCatcher kovalenta interaktioner16, amine tvärbindande via glutaraldehyd13eller biotin-streptividin interaktioner17.
Dynamisk mekanisk analys (DMA) är för närvarande en teknik som i stor utsträckning att studera polymerbaserade hydrogels13,18. Även DMA kan gälla biomaterial med konstant kraft protokoll, kräver det Youngs moduli över 10 kPa, och stora provmängder på mer än 200 µL19. På grund av dessa begränsningar är i allmänhet alltför mjuk för utredas av denna teknik protein hydrogels. Som konstruerade polyproteins är svårare att syntetisera än polymerer, eftersom de kräver ett levande system att producera, är så höga volymer ineffektiva, bästa4,15. Dessutom är de flesta biologiska vävnader mjukare än 10 kPa. Flera metoder har utvecklats för biologiska prover, särskilt i studien av muskel elasticitet20,21. Dessa tekniker kan också verka under feedback att tillämpa konstant kraft men är optimerade för prover med små diametrar (i intervallet micron) utsätts för för mycket korta (vanligtvis mindre än 1 s).
Protein-baserade hydrogels studerades framgångsrikt med modifierad reometri tekniker. Till exempel tillåter gjutning av hydrogel i en ringform användning av utvidgande reometri att mäta förändringen i den erfarna kraften som en funktion av förlängning4,22. Andra metoder för att studera de reologiska egenskaperna hos protein-baserade hydrogels använda kontrollerade skjuvspänningen-reometri. Dessa tekniker kan också uppnå låg provvolymen och tolerera mjuka material. Men dessa metoder saknar förmågan att härma dra styrkor att orsaka protein utspelas i vivooch Youngs modul beräknas baserat på komplexa teorier som kräver olika antaganden och korrigeringar23.
Vi har nyligen rapporterat en ny metod som använder en liten mängd proteiner, polymeriseras inuti rör med diametrar < 1 mm. Vårt första genomförande av denna teknik var verksamma i längd-clamp-läge, där gelen förlängdes efter de önskade protokoll15. I denna metod uppleva proteinerna en kontinuerlig förändring i både förlängning och kraft medan domänerna utvecklas, vilket gör tolkningen av data besvärlig. Vi rapporterade nyligen, har en ny kraft-clamp reometri teknik, där en feedbackloop kan exponera låg volym protein hydrogels till en fördefinierad kraft protokoll7 (figur 2). En analog PID-systemet jämför den kraft som mäts av den kraft sensorn med börvärdet skickas från datorn och justerar tillägget gel genom att flytta den talspole att minimera skillnaden mellan de två ingångarna. Denna ‘fastspänning’ av kraft gör nu för nya typer av experiment att mäta biomekanik av protein hydrogels.
I kraft-ramp läge erfar en tjudrad protein hydrogel en konstant ökning och minskning av våld med tiden. PID kompenserar för alla viskoelastiska deformation genom att ändra filnamnstillägget i ett icke-linjärt sätt, beroende på typ av protein och hydrogel formulering. Den största fördelen med kraft ramp är att det tillåter kvantifiering av standard parametrar, såsom Youngs modul och energiupptagning, på grund av en utspelas och vika av protein domäner.
I konstant-force läge ändras den tillämpliga kraften i en steg-liknande sätt. I det här läget gelen utökar och kontrakt elastiskt när kraften ökas eller minskas, respektive, följt av en tidsberoende deformationer. Detta viskoelastiska deformation, äger rum medan gelen erfar en konstant kraft, är direkt relaterad till domän utspelas/vika. På ett förenklat sätt, kan denna förlängning ses som motsvarar flera miljarder enda molekyl spår i genomsnitt tillsammans och mätt på en gång. Konstant-force protokoll kan användas för att studera krypning och uppmjukning av protein hydrogels som en funktion av kraft och tid. Som en funktion av kraft, för BSA-baserade protein hydrogels, har vi nyligen visat att det finns ett linjärt samband mellan elastiska och viskoelastiska förlängning och rekyl med tillämpad stam7.
Här detalj vi driften av en kraft-clamp reometer använder komposit geler gjorda av en blandning av protein L (8 domäner24, avbildad som L8) och en protein L-andra konstruktion (L-andra), vilket gör den totala hydrogel fluorescerande och lätt att demonstrera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri, beskriver vi en kraft-clamp reometri teknik för att undersöka den biomekaniska Svaren av låg volym proteinbaserade hydrogels. Dessutom finns ett protokoll för att syntetisera en enhetliga cylindriska låg volym protein hydrogel provet. Ett protokoll är också presenteras som beskriver hur man knyter olika typer av protein-baserade hydrogels med olika elasticiteter utan att orsaka någon mekanisk deformation eller skada proteinbaserade hydrogel prover eller glidning av gelen på krokar. Det analoga PID-systeme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner finansiellt stöd från forskning tillväxtinitiativet (Award nr 101 X 340), National Science Foundation, större forskningsprogram instrumentering (Grant nr. PHY-1626450), större Milwaukee Foundation (Shaw Award) och University of Wisconsin System (tillämpad forskning Grant).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
Riferimenti
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?. Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chimica. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
