Protein Bazlı Hydrogels karakterize için kuvvet-kelepçe Rheometry
Summary
Yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry teknik bir ses bobini motor ve bir kuvvet sensör arasında gergin düşük hacimli protein bazlı hidrojel örnekleri mekanik özelliklerini araştırmak için kullanılır. Bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi ‘için istenen protokol deneyimli kuvvet sıkma için’ sağlar.
Abstract
Burada, protein bazlı hydrogels biyomekanik özellikleri tanımlamak için bir kuvvet-kelepçe rheometry yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi bir doğrusal ses bobini motor ve güç dönüştürücü gergin silindirik protein bazlı hidrojel örnekleri üzerinde kontrol-force iletişim kuralları uygulamak için kullanır. İşlem sırasında ölçülen ve ayar noktası kuvvetleri arasındaki farkı en aza indirerek bir önceden tanımlanmış kuvvet protokolü takip etmek hidrojel örnek uzantısı PID sistemi ayarlar. Hydrogels protein bazlı benzersiz bu yaklaşım son derece düşük hacimli hidrojel örnekleri (< 5 µL) farklı protein konsantrasyonları ile hayvan zinciri sağlar. Burada uygulanan stres artırır ve doğrusal olarak zamanla azalır, kuvvet rampa protokolleri altında sistem (BM) proteinler ve standart elastik ölçümü katlama ile ilişkilendirilen esneklik ve histeresis davranışlar çalışma sağlar ve visko elastik parametreler. Sabit-kuvvet, güç darbe bir adım benzeri şekli, elastik yanıt, kusura bakma ama değişikliği yürürlükte, sahip olduğu unfolding ve refolding protein etki alanından gelen viskoelastik yanıt dan bilgisini iletmiyor altındadır. Düşük hacimli örnek ve çeşitli mekanik tedirginlikler uygulanmasında çok yönlülük nedeniyle kuvvet-kelepçe rheometry proteinlerin bir toplu yaklaşım kullanarak kuvveti altında mekanik yanıt araştırmak için optimize edilmiştir.
Introduction
Benzersiz fiziksel özelliklere sahip olma dışında protein bazlı hydrogels kuvvet Spektroskopi böylece protein kalabalık ortamlarda çalışma etkinleştirme bir ‘Çek’, içinde birkaç milyar molekülleri ölçümü etkinleştirerek devrim sözü tutun, Bu deri ve diğer doku karşılaştı benzer. Ortakları ve kimyasal koşullar bağlayıcı protein etki alanları zorlamak için biyomekanik cevapları çalışma izin hydrogels içinde katlanmış olarak kalır. Buna ek olarak, hydrogels içinde protein etki alanlarının biyomekanik yanıt tek molekül kuvvet Spektroskopi teknikleri ile görülen yanıt benzer. Örneğin, kimyasal denatüranlar ve oksitleyici ajanlar istikrar katlanmış devletin tek protein etki alanı düzey1,2,3 hem de makroskopik düzey4,5 azaltmak , 6 , 7. benzer şekilde, osmolytes hydrogels, visko elastik yanıt azalmasına aynı koşullar7,10kuvvet için önde gelen tek proteinler8,9, kararlılığı artırır.
Birkaç yaklaşım hydrogels, protein bazlı sentez için tarafından uygulanmış olan fiziksel etkileşimleri11,12 -kovalent cross-linking4,13kullanarak. Kovalent reaksiyonları sabit cross-linking yerlerde için izin ve bu hydrogels mekanik veya kimyasal tedirginlikler kaldırılması üzerine başlangıç durumu kurtarabilirsiniz. Amonyum Persülfat (APS) bir oksidan ve Rutenyum (II) tuzu kullanarak bir başlatıcı (Şekil 1)14olarak maruz Tirozin amino asitler arasındaki kovalent karbon-karbon bağları oluşturan kovalent cross-linking için başarılı bir yaklaşım kullanır. Beyaz ışığa maruz kalma konsantre proteinlerin bir çözüm-ebilmek var olmak dönük hidrojel. Reaksiyon başlar, protein-APS karışımı herhangi bir döküm formu enjekte edilebilir güncelleştirip kontrol ederek Politetrafloroetilen (PFTE) gibi tüpler (Şekil 1B ve 1 C), son derece küçük çözüm cilt15kullanımını sağlar. Ayrıca, cross-linking tepki tetiklemek için beyaz ışık kullanımı sonuçlar floresan proteinlerin sınırlı bir beyazlatma ve bileşik hydrogels formülasyonu floresan işaretleri (Şekil 1) ile sağlar. SpyTag-SpyCatcher kovalent etkileşim16, Amin cross-linking via oxazolidin13veya biotin streptavidin etkileşimi17temel cross-linking diğer protein bazlı hidrojel oluşumu yöntemleri kullanın.
Dinamik mekanik analiz (DMA), şu anda yoğun polimer esaslı hydrogels13,18çalışma için kullanılan bir tekniktir. DMA Biyomalzeme için sürekli güç iletişim kuralları uygulayabilirsiniz olmakla birlikte, üzerinde 10 kPa ve 200’den fazla µL19hacimleri büyük örnek Young’un dönmeler gerektirir. Bu sınırlamalar nedeniyle, protein hydrogels genellikle bu tekniği ile araştırılması çok yumuşak. Mühendislik polyproteins üretmek için canlı bir sistem gerektiren bu yana polimerler sentez zordur bu tür yüksek birimleri en iyi4,15‘ verimsiz şunlardır. Ayrıca, çoğu biyolojik doku 10 kPa yumuşak. Birkaç yaklaşım kas elastikiyeti20,21çalışmada özellikle biyolojik örnekler için geliştirilmiştir. Bu teknikler de sürekli kuvvet uygulamak için geribildirim altında çalışabilir ama örnekleri çok kısa zamanlar için zorlamaya maruz küçük çapı (mikron aralığındaki) için optimize edilmiş (genellikle daha az 1 s).
Protein bazlı hydrogels tarihinde rheometry teknikleri ile başarılı bir şekilde incelenmiştir. Örneğin, bir halka şeklinde hidrojel döküm deneyimli kuvvet değişikliği uzantısı4,22bir fonksiyonu olarak ölçmek için extensional rheometry kullanımına izin verir. Protein bazlı hydrogels rheological özelliklerini çalışmak için diğer yaklaşımlar kontrollü kesme-stres rheometry kullanın. Bu teknikler de düşük numune hacmi elde etmek ve yumuşak malzeme tahammül. Ancak, bu yöntemleri eksikliği çekerek taklit yeteneği o neden protein unfolding içinde vivozorlar ve Young katsayısı çeşitli varsayımlar ve düzeltmeler23gerektiren karmaşık teorileri dayanarak hesaplanır.
Son zamanlarda küçük hacimli tüp çapı içindeki polimerli proteinlerin kullanan yeni bir yaklaşım bildirdin < 1 mm. Bu teknik ilk bizim uygulanması nerede jel istenen protokol15genişletildi uzunluğu-kelepçe modunda çalışan. Etki alanlarını açılmak iken, bu yöntemde, veri yorumu hantal yapma sürekli bir değişim uzantısı ve kuvvet proteinler deneyim. Son zamanlarda, yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry tekniği, nerede bir geri besleme döngüsü düşük hacimli protein hydrogels bir önceden tanımlanmış kuvvet Protokolü7 (Şekil 2) açığa çıkarabilir bildirdin. Analog bir PID sistemi ile bilgisayardan gönderilen ayar noktası kuvvet algılayıcı ile ölçülmüş güç karşılaştırır ve iki giriş arasındaki fark en aza indirmek için ses bobini taşıyarak jel uzantısı ayarlar. Bu ‘sıkma kuvveti’ Şimdi yeni türlerine deneyler için protein hydrogels biyomekanik ölçmek için izin verir.
Kuvvet rampa modunda bir hayvan zinciri protein hidrojel sürekli artış ve zamanla kuvvet azalması deneyimleri. PID doğrusal olmayan bir şekilde, protein ve hidrojel formülasyonu türüne bağlı olarak uzatma değiştirerek için herhangi bir visko elastik deformasyon oluşan koyu çizgileri giderir. Kuvvet rampa en büyük avantajı Young katsayısı ve bir unfolding ve protein etki alanından refolding nedeniyle enerji dağıtımı gibi standart parametreler miktar sağlanmıştır.
Sabit-force modunda uygulanan kuvvet bir adım gibi moda değiştirir. Bu modda, jel genişletir ve kuvvet artırılması veya azaltılması, anılan sıraya göre ne zaman Melosun sözleşmeleri, zamana bağımlı deformasyon tarafından takip. Sabit bir güç, jel deneyimleri sırasında gerçekleşen bu visko elastik deformasyon etki alanı unfolding/refolding için doğrudan ilgilidir. Basitleştirilmiş bir şekilde, bu uzantı ortalama ve tek seferde ölçülen birkaç milyar tek molekül izlemeler eşdeğeri olarak görülebilir. Sabit-force protokolleri sürüngen ve protein hydrogels gevşeme kuvvet ve zamanın bir fonksiyonu olarak kullanılabilir. BSA tabanlı protein hydrogels için güç bir fonksiyonu olarak biz son zamanlarda elastik ve viskoelastik uzantısı ve geri tepme ile uygulanan gerilim7arasında doğrusal bir bağımlılık olduğunu göstermiştir.
Burada bir kuvvet-kelepçe rheometer bileşik jelleri protein L (L8olarak tasvir 8 etki24,) bir karışımı ve bir protein L-eGFP yapısı (L-eGFP), yapılan genel hidrojel yapar floresan ve basit-e doğru kullanma işlemi ayrıntılı göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, düşük hacimli protein bazlı hydrogels biyomekanik yanıt araştırmak için bir kuvvet-kelepçe rheometry tekniğini tanımlamak. Ayrıca, bir protokol Tekdüzen silindirik düşük hacimli protein hidrojel örnek sentezlemek için sağlanmıştır. Bir iletişim kuralı da nasıl kanca herhangi bir mekanik deformasyon veya protein bazlı hidrojel örnekleri veya kayma jel zarar vermeden farklı protein bazlı hydrogels çeşitli elasticities ile bağlamayı açıklayan sunulur. Doğrusal ses bobini ve kuvvet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma büyüme girişimi (Ödülü No 101 X 340), Ulusal Bilim Vakfı, büyük araştırma araçları programı (Grant No mali desteği anıyoruz PHY-1626450), büyük Milwaukee Vakfı (Shaw Ödülü) ve University of Wisconsin sistemi (uygulamalı araştırma hibe).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
Riferimenti
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?. Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chimica. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
