Vi præsenterer her, en protokol til model menneskelige tuberkulose i en voksen zebrafisk ved hjælp af dens naturlige patogen Mycobacterium marinum. Ekstraherede DNA og RNA fra de indre organer hos inficerede zebrafisk kan bruges til at afsløre alt mykobakterielle belastninger i fisk og værtens immunrespons med qPCR.
Mycobacterium tuberkulose er i øjeblikket den dødeligste menneskelige patogen forårsager 1,7 millioner dødsfald og 10,4 millioner infektioner hvert år. Eksponering for denne bakterie forårsager en bred sygdom spektrum i mennesker lige fra en steriliseret infektion til et aktivt fremadskridende dødelig sygdom. Den mest almindelige form er den latent tuberkulose, som er asymptomatiske, men har potentiale til at genaktivere i et fulminant sygdom. Voksen zebrafisk og dens naturlige patogen Mycobacterium marinum har for nylig vist sig for at være en relevant model til at studere det brede sygdom spektrum af tuberkulose. Vigtigere, kan spontane ventetid samt reaktivering og adaptive immunrespons i forbindelse med mykobakterielle infektion studeres i denne model. I denne artikel vil beskrive vi metoder for eksperimentel infektion af voksen zebrafisk, indsamling af indre organer til udvinding af nukleinsyrer til måling af mykobakterielle belastninger og vært immunrespons ved kvantitativ PCR. Den i in-House udviklede, M. marinum –specifikke qPCR analyse er mere følsomme end de traditionelle plating metoder som det registrerer også DNA fra ikke-dividere, sovende eller for nylig døde mykobakterier. Som både DNA og RNA er udvundet fra den samme person, er det muligt at studere forholdet mellem den syge stat og vært og patogen genekspressionen. Voksen zebrafisk model for tuberkulose dermed præsenterer sig selv som en yderst relevant, ikke-pattedyr i vivo system at studere vært-patogen interaktioner.
Zebrafisk (Danio rerio) er et udbredt dyremodel i biomedicinsk forskning, og det er en accepteret model for fælles hvirveldyr biologi. For zebrafisk er blevet tilpasset til mange forskningsområder modellering menneskelige sygdomme og lidelser lige fra kræft1 og hjertesygdom2 til infektion og immunologiske undersøgelser af flere bakterielle 3 og virusinfektioner4 , 5. Derudover ex utero udviklingen af zebrafisk embryoner har gjort zebrafisk en populær model i udviklingsmæssige biologi6 og toksikologi7,8.
I mange områder af forskning, herunder infektion biologi, er optisk gennemsigtig zebrafisk larver almindeligt anvendt. De første immunceller vises inden for 24 timer post befrugtning (hpf), når primitive makrofager er opdaget9. Neutrofiler er de næste immunceller at dukke op omkring 33 hpf10. Zebrafisk larver er således muligt for at studere de tidlige stadier af infektion og rollen af medfødt immunitet i mangel af adaptive immunceller11. Men de voksne zebrafisk med sit fuldt funktionel adaptive immunsystem giver et ekstra lag af kompleksitet til infektion eksperimenter. T-celler kan påvises omkring 3 dage efter befrugtningen12, og B-celler er i stand til at producere funktionelle antistoffer ved 4 uger post befrugtning13. Den voksne zebrafisk har alle de vigtigste modstykker af de pattedyr medfødte og adaptive immunsystem. De væsentligste forskelle mellem immune systems af fisk og mennesker er fundet i antistof isotypes såvel som i anatomi af lymfoide væv. For zebrafisk har kun tre antistof klasser14, der henviser til, at mennesker har fem15. I mangel af knoglemarven og lymfeknuderne, den primære lymfoide organer i fisk nyre og thymus16 og milten, nyrerne og tarmen tjene som sekundære lymfoide organer17. Trods disse forskelle, med dens fulde immun arsenal af medfødte og adaptive celler, er de voksne zebrafisk en yderst relevant, nem at bruge, ikke-pattedyr model for vært-patogen interaktion undersøgelser.
For zebrafisk er sidst blevet etableret som en mulig model til at studere tuberkulose18,19,20,21,22. Tuberkulose er en luftbåren sygdom forårsaget af Mycobacterium tuberkulose. Ifølge World Health Organization, tuberkulose forårsaget1,7 million dødsfald i 2016 og er den hyppigste årsag til død af en enkelt patogen verdensomspændende23. Mus24,25, kaniner26 og ikke-menneskelige primater27 er det mest kendte dyr modeller i tuberkulose forskning men hvert ansigt deres begrænsninger. Primat model af M. tuberkulose -infektion ligner den menneskelige sygdom mest tæt, men ved hjælp af denne model er begrænset på grund af alvorlige etiske overvejelser. Andre animalske modeller er hæmmet af værtsspecificitet M. tuberkulose , der påvirker sygdommen patologi. Sandsynligvis det største problem i modellering tuberkulose er den bredt spektrum af infektion og sygdom resultater i den menneskelige sygdomme: tuberkulose er en meget heterogen sygdom spænder fra sterilisering immunitet til latente, aktive og reaktiveret infektion28 , som kan være svært at reproducere og model eksperimentelt.
Mycobacterium marinum er en nær slægtning af M. tuberkulose med ~ 3.000 orthologous proteiner med 85% aminosyre identitet29. M. marinum inficerer naturligt zebrafisk producerer granulomer, kendetegnende for tuberkulose, i sit indre organer19,30. I modsætning til andre animalske modeller anvendes i tuberkulose forskning, zebrafisk producerer mange afkom, det kræver kun en begrænset plads og vigtigst, det er neurophysiologically de mindst udviklede hvirveldyr tuberkulose model tilgængelig. Derudover forårsager M. marinum infektion latent infektion, aktiv sygdom eller endda Sterilisation af mykobakterielle infektion i voksen zebrafisk nøje efterligne spektrum af sygdom resultater af menneskelig tuberkulose19, 31 , 32. her, vi beskriver metoder til den eksperimentelle tuberkulose model af voksne zebrafisk ved at indsprøjte M. marinum ind i bughulen og bruge kvantitativ PCR til at måle mykobakterielle belastninger og immunrespons fra zebrafisk vævsprøver.
Her beskriver vi en qPCR-baseret program til at måle mykobakterielle belastninger fra DNA ekstraheret fra eksperimentelt inficerede voksne zebrafisk væv. Dette program er baseret på primere designet omkring 16S-23S rRNA interne transskriberede spacer sekvens40. Den totale mykobakterielle belastning i en fisk prøve anslås ved hjælp af en standardkurve, der er fremstillet af DNA ekstraheret fra et kendt antal kulturperler mykobakterier og under forudsætning af at en bakterie har en kopi af de…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er blevet støttet af den finske kulturelle fundament (HL), Tampere tuberkulose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), grundlaget for den finske Anti-tuberkulose Association (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane og Aatos Erkko Foundation (M.P.) og Finlands Akademi (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo og Jenna Ilomäki er anerkendt for deres tekniske bistand. Forfatterne anerkender Tampere zebrafisk laboratorium for deres service.
Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Chloroform | VWR | 22711.290 | |
Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
Sonicator m08 | Finnsonic | ||
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |