Inducción de las placas ateroscleróticas a través de la activación de los receptores de mineralocorticoides en ratones deficientes en apolipoproteína E
Summary
Se describe un protocolo para inducir ateroesclerosis en la raíz aórtica de ApoE– / – los ratones alimentados con una dieta aterogénico, a través de una continua liberación de aldosterona. También se describen métodos para caracterizar la composición de la placa.
Abstract
Aterosclerosis es debido a una respuesta inflamatoria crónica que afecta el endotelio vascular y es promovida por varios factores como la hipertensión, la dislipidemia y la diabetes. Hasta la fecha, hay evidencia para apoyar un papel circulante aldosterona como un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. Se han generado modelos de ratón transgénico para estudiar procesos celulares y moleculares que llevan a la aterosclerosis. En este manuscrito, se describe un protocolo que se aprovecha de la infusión continua de la aldosterona en ApoE– / – ratones y genera las placas ateroscleróticas en la raíz aórtica después de 4 semanas de tratamiento. Nosotros, por lo tanto, ilustra un método para la cuantificación y caracterización de las lesiones ateroscleróticas en la raíz aórtica. El valor añadido de la infusión de aldosterona está representado por la generación de las lesiones ateroscleróticas ricas en lípidos y células inflamatorias después de 4 semanas de tratamiento. Describimos en detalle los procedimientos de tinción para cuantificar el contenido de lípidos y macrófagos dentro de la placa. En particular, en este protocolo, realizamos corazón tejido-inclusión en OCT con el fin de preservar la antigenicidad del tejido cardíaco y facilitar la detección de antígenos de interés. Análisis del fenotipo de placa representa un enfoque válido para el estudio de la fisiopatología del desarrollo de aterosclerosis y para identificar nuevas dianas farmacológicas para el desarrollo de fármacos anti-aterogénicos.
Introduction
La ateroesclerosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo1. Se caracteriza por un estado inflamatorio crónico donde los vasos sanguíneos están infiltrados por los lípidos y leucocitos que determinan la formación de placas ateroscleróticas. La mayoría de los eventos cardíacos agudos se asocian con eventos trombóticos debido a la ruptura de la placa. Propensos a la ruptura de las placas se definen “vulnerables” y se caracterizan por la infiltración creciente de leucocitos proinflamatorios, un núcleo necrótico y una cubierta fibrosa delgada2. En las últimas décadas, estudios clínicos y experimentales han aclarado la compleja Fisiopatología de la enfermedad. Varios modelos animales se utilizan para investigar los mecanismos moleculares implicados en la inducción de ateroesclerosis3. Actualmente, el ratón es la especie más frecuentemente usada para el estudio de ateroesclerosis a pesar de algunas diferencias específicas de especies existentes en su fisiopatología en comparación con los seres humanos. En particular, colesterol de circulación está compuesto principalmente por lipoproteínas de alta densidad (con propiedades antiaterogénica) en modelos de ratón, mientras que en los seres humanos circulantes de colesterol principalmente es transportado como lipoproteínas de baja densidad (LDL), probablemente que representa la razón principal por qué ratones de tipo salvaje no desarrollan aterosclerosis espontánea4. Además, ratones de tipo salvaje son generalmente resistentes a la absorción de colesterol de la dieta, mientras que los seres humanos absorben aproximadamente el 50% de colesterol de la dieta4. Para superar estas limitaciones, se han generado varios modelos de ratón modificados genéticamente. Apolipoproteína E-deficiente ratón (ApoE−/−) y el ratón – deficiencia del receptor de LDL (LDLr−/−) son ampliamente utilizados. En una dieta de alto contenido de grasa de colesterol alto, ApoE−/− ratones desarrollan placa más rápidamente en comparación con ratones−−/LDLr, y por esta razón, el uso de ratones− −/ApoE es más extenso que el de LDLr−/−ratones5,6. Los ratones− −/de ApoE desarrollan lesiones en cualquier etapa de la aterosclerosis y son comparables a los observados en seres humanos, aunque las placas de ratón no muestran un fenotipo inestable7. Generalmente, ApoE−/− ratones espontáneamente desarrollan aterosclerosis y este proceso se acelera con una dieta occidental3. La severidad de la aterosclerosis puede ser evaluada a nivel de la carótida, femoral, pulmonar y la arteria braquiocéfala y la raíz aórtica6. En particular, la raíz aórtica representa un sitio anatómico propenso para el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones. Por esta razón, es práctica común para evaluar la formación de placas ateroscleróticas en esta región.
Varios estudios han demostrado que la aldosterona está implicada en el desarrollo de ateroesclerosis8,9,10. Infusión de aldosterona en ApoE−/− ratones alimentados con una dieta aterogénico acelera el desarrollo de lesiones ateroscleróticas de la raíz aórtica inductora de la formación de placa inflamada y rico en lípidos10.
En Resumen, se describe un protocolo de infusión de la aldosterona, aterogénico dieta alimentación, fijación de los tejidos del corazón, cuantificación y caracterización de las lesiones ateroscleróticas en ApoE– / – ratones. Este procedimiento promueve una eficiente formación de placas ateroscleróticas inflamadas, rico en lípidos y representa un modelo valioso para el estudio de la aterogénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ateroesclerosis es un trastorno inflamatorio crónico asociado con vasos grandes y medianos que implican interacciones entre múltiples tipos de células, como macrófagos, linfocitos T, células endoteliales y músculo liso células1. A pesar de las limitaciones de modelos murinos aterogénicos, existe un gran cuerpo de evidencia en el proceso aterosclerótico. Estos modelos tienen la ventaja de generar rápidamente cohortes experimentales de una edad específica y sexo. Ratones muestran tambi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio italiano de salud (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 y PE-2011-02347070 a M.C.)
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
Riferimenti
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