تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم
Summary
يمكننا وصف بروتوكول لتحديد الأنواع الفرعية اللمفاويات باستخدام تصوير المرحلة الكمية وخوارزميه تعلم آلة خالية من التسمية. قياسات توموجرامس 3D الانكسار من الخلايا الليمفاوية يقدم معلومات ثلاثية الأبعاد المورفولوجية والبيوكيميائية للخلايا الفردية، التي ثم يتم تحليل خوارزمية التعلم الآلي للتعرف على أنواع الخلايا.
Abstract
يصف لنا هنا بروتوكولا لتحديد الأنواع الفرعية اللمفاويات باستخدام تصوير المرحلة الكمية وآله التعلم خالية من التسمية. تحديد أنواع فرعية اللمفاويات مهم لدراسة علم المناعة، فضلا عن تشخيص وعلاج الأمراض المختلفة. حاليا، تعتمد الأساليب القياسية لتصنيف أنواع اللمفاويات على وسم البروتينات الغشاء محددة عن طريق التفاعلات ضد مستضد. ومع ذلك، هذه التقنيات وصفها تحمل المخاطر المحتملة لتغيير الوظائف الخلوية. البروتوكول هو موضح هنا يتغلب على هذه التحديات عن طريق استغلال التناقضات البصرية الجوهرية تقاس بتصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة وخوارزميه آلة تعلم. قياس الانكسار 3D (RI) توموجرامس من الخلايا الليمفاوية معلومات كمية عن مورفولوجيا 3D وتعمل الخلايا الفردية. ثم يتم تحليل البارامترات الفيزيائية المستخرجة من توموجرامس ري 3D قياس كمي مع خوارزمية تعلم جهاز، مما يتيح تحديد أنواع اللمفاويات على مستوى خلية واحدة خالية من التسمية. قياس توموجرامس ري 3D من الخلايا اللمفية CD4 + T ب و CD8 + T، والتعرف على أنواع الخلايا مع أكثر من 80% الدقة. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات التفصيلية لعزل الخلايا اللمفاوية، وتصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة، وآله التعلم لتحديد أنواع اللمفاويات.
Introduction
ويمكن تصنيف الخلايا الليمفاوية إلى أنواع فرعية مختلفة بما في ذلك ب، مساعد التائية (CD4 +) والسامة للخلايا (CD8 +) تي تي التنظيمية الخلايا. يحتوي كل نوع اللمفاويات على دوراً مختلفاً في النظام المناعي التكيفي؛ على سبيل المثال، تنتج الخلايا الليمفاوية ب الأجسام المضادة، بينما لمفاوية T كشف المستضدات محددة والقضاء على الخلايا غير الطبيعية، وتنظيم الخلايا الليمفاوية ب. وظيفة اللمفاويات وتنظيم محكم يسيطر عليها والمتعلقة بمختلف الأمراض بما فيها السرطان1،2من أمراض المناعة الذاتية، والعدوى الفيروسية3. وبالتالي، من المهم تحديد أنواع اللمفاويات على فهم أدوارهم الفيزيولوجية المرضية في مثل هذه الأمراض والعلاج المناعي في العيادات.
حاليا، تعتمد أساليب لتصنيف أنواع اللمفاويات على التفاعلات ضد مستضد باستهداف البروتينات الغشاء السطحي محددة أو علامات السطح4. استهداف علامات السطحية طريقة دقيقة ودقيقة لتحديد أنواع اللمفاويات. ومع ذلك، فإنه يتطلب الكواشف باهظة الثمن وإجراءات تستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي على مخاطر تعديل الهياكل بروتين الغشاء وتحوير الوظائف الخلوية.
للتغلب على هذه التحديات، يدخل البروتوكول الموصوفة هنا تحديد أنواع اللمفاويات باستخدام المرحلة الكمية 3D التصوير (كبي) وآله التعلم5خالية من التسمية. هذا الأسلوب يتيح لتصنيف أنواع اللمفاويات على مستوى خلية واحدة استناداً إلى الخصائص المورفولوجية المعلومات المستخرجة من تصوير 3D تسمية خالية من الخلايا الليمفاوية الفردية. خلافا لتقنيات الفحص المجهري الفلورية التقليدية، يستخدم قبي الانكسار (RI) توزيعات (الخصائص البصرية الأصيلة للخلايا الحية والأنسجة) كالتباين الضوئي6،7. وتمثل توموجرامس ري من الخلايا الليمفاوية الفردية المظهرية معلومات محددة لأنواع فرعية من الخلايا الليمفاوية. وفي هذه الحالة، عناصره استخدام 3D توموجرامس ري من الخلايا الليمفاوية الفردية، استخدم خوارزمية تعلم تحت إشراف جهاز.
باستخدام تقنيات مختلفة كبي، توموجرامس ري 3D للخلايا بنشاط استخدمت لدراسة الخلية الفيزيولوجيا المرضية لأنها توفر تسمية مجاناً، كمية التصوير قدرة8،،من910، 11،،من1213. أيضا، يمكن أن توفر توزيعات ري 3D من خلايا فردية المورفولوجية والكيميائية الحيوية والنشاط الحيوي من المعلومات حول الخلايا. 3D ري توموجرامس قد استخدمت سابقا في مجالات أمراض الدم14،15،،من1617،18،الأمراض المعدية19، 20، علم المناعة21، خلية علم الأحياء22،23، التهاب24، السرطان25، علم الأعصاب26،27، علم الأحياء التنموي28، وعلم السموم 29، وعلم الأحياء الدقيقة12،30،،من3132.
على الرغم من أن 3D ري توموجرامس توفير معلومات تفصيلية المورفولوجية والبيوكيميائية للخلايا، أمر يصعب تحقيقه ببساطة التصوير 3D توموجرامس ري5تصنيف الأنواع الفرعية اللمفاويات. منهجياً وكمياً استغلال توموجرامس ري 3D قياس لتصنيف نوع الخلية، ونحن تستخدم خوارزمية تعلم آلة. في الآونة الأخيرة، عدة أعمال أفيد في المرحلة الكمية التي تم تحليل صور خلايا مع مختلف آلة التعلم خوارزميات33، بما في ذلك الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة34، تصنيف جنس البكتيرية35 , الآلي 36، الكشف السريع وخاليا من جراثيم الجمرة الخبيثة37، تحليل الخلايا المنوية38، وتحليل لسرطان خلايا39،40، والكشف عن التنشيط بلعم41.
يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية القيام بتحديد أنواع اللمفاويات على مستوى الخلية الفردية باستخدام 3D كبي وآله التعلم خالية من التسمية. وهذا يشمل: 1) اللمفاويات في معزل عن الدم الماوس وفرز الخلايا اللمفاوية 2) عن طريق التدفق الخلوي، كبي 3) ثلاثي الأبعاد، استخراج ميزة 4) كمية من 3D ري توموجرامس والتعلم 5) تحت إشراف لتحديد أنواع اللمفاويات.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكول التي تمكن من تحديد أنواع اللمفاويات استغلال المرحلة الكمية 3D تصوير وآله التعلم خالية من التسمية. الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول تصوير وميزة اختيار المرحلة الكمية. للتصوير المجسم الأمثل، ينبغي أن تتم مراقبة كثافة الخلايا كما هو موضح أعلاه. الاستقرار الميكانيكي للخلايا مه…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل الكوري BK21 + البرنامج, توموكوبي, Inc.، والوطنية بحوث مؤسسة كوريا (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 ك 000396). يوسف جو تسلم الدعم من الزمالات الرئاسي الكوري واسان منحة العلوم الطبية الحيوية.
Materials
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
Riferimenti
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
- Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
- Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
- Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
- Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
- Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
- Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
- Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
- Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
- Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
- Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
- Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
- Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
- Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
- Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
- Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
- Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
- Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
- Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
- Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
- Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
- Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
- Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
- Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
- Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
- Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
- Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
- Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
- Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
- Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
- Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
- Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
- Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
- Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
- Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
- Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).
