JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

라벨-무료 3 차원 양적 위상 이미징 사용 하 여 림프 구의 식별 및 기계 학습

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

우리의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 tomograms의 측정 3D 형태학 및 생화학 정보 개별 셀에 대 한 다음 종류의 식별을 위한 기계 학습 알고리즘으로 분석을 제시.

Abstract

여기의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 식별 진단 면역학의 연구 및 다양 한 질병의 치료에 대 한 중요 하다. 현재, 항 원-항 체 반응을 통해 특정 막 단백질을 라벨에 의존 하는 림프 구 종류를 분류 하기 위한 표준 방법. 그러나, 이러한 라벨 기술을 세포 기능 변경의 잠재적인 위험. 여기에 설명 된 프로토콜 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘에 의해 측정 하는 내장 광학 대조를 이용 하 여 이러한 문제를 극복 한다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 (RI) tomograms의 측정 3 차원 형태 및 개별 셀의 고기에 대 한 정량적 인 정보를 제공합니다. 측정 된 3D 리 tomograms에서 추출 생물 매개 변수는 양적 단일 세포 수준에서 림프 구 종류의 식별 라벨 무료 사용 기계 학습 알고리즘으로 분석 됩니다. 우리는 B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨의 3D RI tomograms를 측정 하 고 80% 이상으로 그들의 세포 유형 식별 정확도. 이 프로토콜에서 우리는 림프 구 분리, 3D 양적 위상 이미징 및 림프 구 종류를 식별 하기 위한 기계 학습에 대 한 자세한 단계를 설명 합니다.

Introduction

림프 톨 B, 도우미 (CD4 +) T, 세포 독성 (CD8 +) T, 및 T는 규제를 포함 한 다양 한 하위 유형으로 분류 될 수 있다 세포. 각 림프 구 종류는 다른 역할 적응 면역 체계; 예를 들어 B 림프 톨 생성 항 체, T 림프 톨 특정 항을 검색 하 고 비정상 세포를 제거 하 고, B 림프 톨을 규제 하는 반면. 림프 구 기능 및 규정은 밀접 하 게 의해 제어 되며 암1,2, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염3를 포함 하 여 다양 한 질병에 관련 된. 따라서, 림프 구 종류의 식별은 같은 질병에 immunotherapy 클리닉에 대 한 그들의 병 태 생리 역할을 이해 하는 것이 중요.

현재, 림프 구 종류를 분류 하기 위한 방법 특정 표면 막 단백질 또는 표면 마커4를 대상으로 항 원-항 체 반응에 의존 합니다. 표면 마커를 대상으로 림프 구 종류를 결정 하는 정확 하 고 정확한 방법입니다. 그러나, 그것은 비싼 시 약 및 시간이 걸리는 절차를 요구 한다. 또한, 그것은 막 단백질 구조의 수정 및 세포 기능 변경의 위험을 운반합니다.

이러한 문제를 해결 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 레이블 없는 신분의 림프 구 종류 (QPI) 이미징 3D 양적 단계5를 학습 하는 기계를 사용 하 여 소개 합니다. 이 메서드는 개별 세포의 레이블 없는 3D 영상에서 추출한 형태학 정보에 따라 단일 셀 수준에서 림프 구 종류의 분류를 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 검사 법 기술, 달리 QPI 광학 대조6,7굴절률 (RI) 배포판 (라이브 세포 및 조직의 기본 광학 속성)를 사용합니다. 개별 세포의 RI tomograms 세포의 특정 하위 phenotypic 정보를 나타냅니다. 이 경우에, 개별 세포의 3D RI tomograms를 체계적으로 활용 하는 감독된 기계 학습 알고리즘은 이용 되었다.

다양 한 QPI 기술을 사용 하 여, 셀의 3D RI tomograms 적극적으로 사용 되었습니다 셀 이상의 연구에 대 한 레이블-무료, 제공 하기 때문에 양적 이미징 기능8,,910, 11,,1213. 또한, 개별 셀의 3D 리 배포판 형태학, 생화학, 및 biomechanical 셀에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 3D RI tomograms 이전 혈액학14,15,,1617, 전염병18,19, 의 분야에 이용 되었습니다 20,21면역학, 세포 생물학22,23, 염증24, 암25, 신경 과학26,27, 개발 생물학28, 독극물 29, 그리고 미생물학12,30,,3132.

3D RI tomograms 셀의 자세한 형태학 및 생화학 정보 제공, 림프 구 하위 분류 단순히 3D RI tomograms5을 이미징 하 여 달성 하기 어렵습니다. 체계적으로 그리고 양이 많게 측정된 3D RI tomograms 셀 유형 분류에 대 한 악용, 우리는 기계 학습 알고리즘을 활용. 최근, 여러 작품 보고 되었습니다 어떤 양적 단계에서 셀의 이미지 분석 되었다 다양 한 기계 학습 알고리즘33, 미생물34, 세균성 속35 의 분류의 탐지를 포함 하 여 , 36, 탄 저 균 포자37, 신속 하 고 레이블 없는 감지 자동 정자 세포38의 분석, 암 세포39,40, 분석 및 대 식 세포 활성화41의 검출.

이 프로토콜 3D QPI 및 기계 학습을 사용 하 여 개별 셀 수준에서 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 수행 하는 자세한 단계를 제공 합니다. 이것은 포함 한다: 1) 림프 구 분리 마우스 혈액, 림프 구 2) 3D 리 tomograms에서 흐름 cytometry, 3) 3D QPI, 4) 양적 특징 추출 통해 정렬 및 림프 구 종류를 식별 하는 데 5) 감독된 학습에서.

Protocol

동물 관리 및 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 한국 과학 기술원 (KA2010-21, KA2014-01, 및 KA2015-03)의 승인 아래 수행 했다. 이 연구에서 모든 실험 승인된 지침에 따라 실시 했다. 1. 림프 구 별개로 마우스 피 C57BL/6J 마우스는 CO2 흡입을 통해 안락사는, 일단 마우스 마음에 26 G 바늘을 삽입 하 고 0.3 mL의 혈액을 수집. 직접 넣어 혈액 튜브 100 U/mL 헤 파 린 ?…

Representative Results

그림 1 전체 프로토콜의 구조 과정을 보여 줍니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 B 고립 (n = 149), CD4 + T (n = 95), 및 CD8 + T (n = 112) 림프 톨. 다양 한 각도에서 조명의 위상 및 진폭 정보를 얻으려면 각 림프 톨의 여러 2D 홀로그램 (60 °-60 °)에서 조명의 각도 변경 하 여 측정 되었다. 일반적으로, 50 홀로그램 3D RI tomogram 재구성을 사용할 수 있?…

Discussion

선물이 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습을 이용 하는 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 가능 하 게 하는 프로토콜. 이 프로토콜의 중요 한 단계는 양적 위상 이미징 및 기능을 선택 합니다. 최적의 홀로그램 영상에 대 한 위에 설명 된 대로 셀의 밀도 제어 한다. 셀의 기계적 안정성도 부동 또는 진동 세포 움직임 조명 각도 변화에 따라 홀로그램 측정을 방해 하기 때문에 정확한 3D RI 분포를 얻기…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 KAIST BK21 + 프로그램, Tomocube, Inc., 및 연구 재단의 국립 (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396)에 의해 지원 되었다. Y. 조 KAIST 대통령 친목 및 아산 재단 생물 의학 과학 장학금 지원을 인정합니다.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image