JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Этикетка свободной идентификации лимфоцитов подтипы, с использованием трехмерных количественных этап визуализации и машинного обучения

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Мы описываем протокол для лейбл свободной идентификации подтипы лимфоцитов с помощью количественных этап визуализации и алгоритм машинного обучения. Измерение 3D преломления томограмм лимфоцитов представляют 3D Морфологические и биохимические информации для отдельных ячеек, который затем анализируется с помощью алгоритмов машинного обучения для идентификации типов клеток.

Abstract

Здесь мы описываем протокол для лейбл свободной идентификации подтипы лимфоцитов с помощью количественных фазы создания образов и машинного обучения. Определение подтипы лимфоцит имеет важное значение для исследования иммунологии, а также диагностики и лечения различных заболеваний. В настоящее время стандартные методы для классификации типов лимфоцитов полагаются на маркировке конкретных мембранных белков через реакции антиген антитело. Однако эти методы маркировки несут потенциальные риски изменения клеточных функций. Протокол, описанные здесь преодолевает эти проблемы, используя встроенный оптический контрастов, измеряется изображений 3D количественную фазу и алгоритм машинного обучения. Измерение 3D преломления (RI) томограмм лимфоцитов обеспечивает количественную информацию о 3D морфологии и фенотипы отдельных клеток. Биофизических параметров, извлеченных из измеренных 3D ри томограмм затем количественно проанализированы с алгоритм обучения машины, позволяя лейбл свободной идентификации типов лимфоцитов на уровне одной ячейки. Мы измерить 3D ри томограмм B, T CD4 + и CD8 + T-лимфоцитов и определили их типы клеток с более чем 80% точность. В этом протоколе мы описывают подробные шаги для лимфоцитов изоляции, 3D количественных этап визуализации и машинного обучения для выявления типов лимфоцитов.

Introduction

Лимфоциты могут быть разделены на различные подтипы, включая B, помощник (CD4 +) T, цитотоксических T (CD8 +) и регулирования T клетки. Каждый тип лимфоцит имеет другую роль в адаптивной иммунной системы; например лимфоциты вырабатывают антитела, тогда как Т-лимфоцитов обнаружения специфических антигенов, устранить аномальные клетки и регулировать лимфоцитов. Функцию лимфоцитов и регулирование плотно управляется и относящиеся к различным заболеваниям, включая рак1, аутоиммунных заболеваний2и3вирусных инфекций. Таким образом идентификация типов лимфоцитов имеет важное значение для понимания их патофизиологические ролей в таких заболеваний и для иммунотерапии в клиниках.

В настоящее время методы для классификации типов лимфоцитов полагаются на реакции антиген антитело, нацеленных на конкретные поверхности мембранных белков или поверхностных маркеров4. Ориентация поверхности маркеров является точное и точный метод определения типов лимфоцитов. Однако это требует дорогостоящих реагентов и длительных процедур. Кроме того он несет риски модификация белков мембранных структур и изменения клеточных функций.

Для преодоления этих проблем, описанных здесь протокол вводит лейбл свободный идентификация типов лимфоцитов с помощью 3D количественных этап визуализации (QPI) и машинного обучения5. Этот метод позволяет классификация типов лимфоцитов на уровне одной ячейки на основе морфологических сведений, извлеченных из метки Бесплатные 3D визуализации отдельных лимфоцитов. В отличие от обычных флуоресцентной микроскопии методы QPI использует индекс преломления (RI) дистрибутивов (внутренние оптические свойства живых клеток и тканей) оптических контраст6,7. РИ томограмм отдельных лимфоцитов представляют фенотипические информацию, относящуюся к подтипам лимфоцитов. В этом случае системно использовать 3D ри томограмм отдельных лимфоцитов, использовался алгоритм обучения под наблюдением машины.

Используя различные методы QPI, 3D ри томограмм клеток активно использовались для изучения патофизиологии клеток потому, что они предоставляют метку бесплатно, количественные визуализации возможность8,9,10, 11,12,13. Кроме того 3D ри распределения отдельных ячеек может предоставить морфологических, биохимических и биомеханических информацию о клетки. 3D ри томограмм, ранее использовались в области гематологии14,,1516,17, инфекционные заболевания18,19, 20, иммунологии21, ячейки биологии22,23, воспаление24, рак25, нейронауки26,27, биологии развития28, токсикологии 29и микробиологии12,30,,3132.

Хотя 3D ри томограмм подробно Морфологические и биохимические клеток, классификация лимфоцитов подтипы трудно достичь, просто визуализации 3D ри томограмм5. Воспользоваться систематически и количественно измеряемых 3D ри томограмм для классификации типа клеток, мы использовали алгоритм обучения машины. Недавно несколько работ были зарегистрированы в котором количественных фазе изображения клеток были проанализированы с различных машинного обучения алгоритмов33, включая обнаружение микроорганизмов34, классификация бактериальных род35 , 36, быстрый и бесплатный этикетки обнаружения спор сибирской язвы37, автоматизированный анализ клеток спермы38, анализ рака клеток39,40и выявления активации макрофагов41.

Этот протокол обеспечивает подробные шаги для выполнения лейбл свободной идентификации типов лимфоцитов на уровне отдельных клеток с использованием 3D QPI и машинного обучения. Это включает в себя: 1) лимфоцитов изоляции от мыши крови, 2) лимфоцитов сортировки через поток цитометрии, 3) 3D QPI, 4) количественные функция извлечения из 3D ри томограмм и 5) под наблюдением обучения для выявления типов лимфоцитов.

Protocol

Уход за животными и экспериментальной процедуры выполнялись под номером официального утверждения институциональный уход за животными и использование Комитета KAIST (KA2010-21, KA2014-01 и KA2015-03). Все эксперименты в рамках этого исследования были проведены в соответствии с утвержденными руковод?…

Representative Results

Рисунок 1 показана схема процесса всего протокола. С помощью процедуры, представленные здесь, мы изолированы B (n = 149), CD4 + T (n = 95) и CD8 + T (n = 112) лимфоцитов. Для получения амплитуды и фазы при различных углах освещения, несколько 2D голограммы каждого лимфоци…

Discussion

Мы представляем протокол, который позволяет идентифицировать метку бесплатно лимфоцитов типов использования 3D количественных фазы создания образов и машинного обучения. Важнейшие шаги этого протокола являются количественную фазу изображений и возможность выбора. Для оптимального ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана KAIST BK21 + программа, Tomocube, Inc. и Национальный исследовательский фонд Кореи (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Ю. Джо выражает поддержку от KAIST президентских стипендий и Асан фонд биомедицинской науки стипендию.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction
check_url/it/58305?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image