Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से
Summary
यहां हम anaerobic प्रोटीन शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान, anaerobic प्रोटीन एकाग्रता, और बाद में काइनेटिक लक्षण वर्णन एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड प्रणाली का उपयोग कर । विधि एंजाइम DesB, एक dioxygenase एंजाइम जो अधिक स्थिर और सक्रिय जब शुद्ध और एक anaerobic वातावरण में संग्रहीत है का उपयोग कर सचित्र है ।
Abstract
ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रोटीन, उन एंजाइमों जो एक सब्सट्रेट के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग सहित, स्थिरता कम हो सकता है जब पारंपरिक एरोबिक शुद्धि तरीकों का उपयोग कर शुद्ध । इस पांडुलिपि में anaerobic शुद्धिकरण प्रक्रिया में शामिल तकनीकी विवरणों को दर्शाया गया है, जिसमें बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी, एक दस्ताने बॉक्स में स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के लिए विधियाँ, और प्रोटीन के कैनेटीक्स से पहले के लिए तरीके हैं । इसके अलावा तैयार करने के लिए और एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए एक ऑक्सीजन का उपयोग एंजाइम का काइनेटिक लक्षण प्रदर्शन करने के लिए तरीके हैं । ये विधियां dioxygenase एंजाइम DesB, जीवाणु Sphingobium sp से एक gallate dioxygenase का उपयोग करके सचित्र हैं । तनाव SYK-6 ।
Introduction
एंजाइमों कि लौह या अंय धातुओं का उपयोग ऑक्सीजन को सक्रिय करने के लिए अक्सर एक सेल के वातावरण को कम करने से उनके हटाने की वजह से शोधन प्रक्रिया के दौरान निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इसलिए, इन प्रोटीन सेल lysates के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, बाहरी कम एजेंटों के अधीन हो, या शुद्ध anaerobically के लिए सुनिश्चित करें कि वे इष्टतम एंजाइमी गतिविधि है1,2,3,4। उन एंजाइमों कि ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील है के लिए (विशेष रूप से लौह युक्त एंजाइमों), सभी शुद्धि और लक्षण वर्णन कदम प्रदर्शन करते हुए anaerobic स्थितियों को बनाए रखने के लिए पूरी तरह से उन्हें विशेषताएं आवश्यक है. यह शोधकर्ताओं ने क्रि5,6,7,8 के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति से लेकर अध्ययन के लिए anaerobic कक्षों के दायरे में पूरी प्रयोगशाला सेट अप विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है .
इस के साथ साथ, हम anaerobic शुद्धि और एंजाइम DesB एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड प्रणाली का उपयोग कर के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके की रिपोर्ट । DesB जीवाणु Sphingobium सपा से एक gallate dioxygenase है । तनाव SYK-6 जो LigAB से संबंधित है, वही जीव से एक protocatecuate dioxygenase है । दोनों एंजाइमों प्रकार द्वितीय protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily जो बड़े पैमाने पर9तारीख को अध्ययन नहीं किया गया है रहे हैं, इस superfamily के एंजाइमों के कारण भाग में होने की संभावना निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील जब मानक एरोबिक का उपयोग शुद्ध प्रोटीन शुद्धिकरण के तरीके । के बाद से कुछ PCAD एंजाइमों सब्सट्रेट अभेद के प्रदर्शन जबकि अन्य सब्सट्रेट-विशिष्ट2,10, इस superfamily के आगे लक्षण वर्णन विशिष्ट निर्धारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक है. के रूप में कई एंजाइम superfamilies11,12,13,14,15में मनाया गया है, छोटे अणुओं प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी निषेध या के बंधन के माध्यम से गतिविधि में परिवर्तन कर सकते है अणु allosteric जेब जो वृद्धि या एंजाइमी गतिविधि16में कमी का कारण बनता है अलग करने के लिए । जबकि अकेले कैनेटीक्स एक मॉडुलन के बंधन स्थान अंतर नहीं कर सकते, एक गतिविधि परिवर्तन के परिमाण का निर्धारण प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के रूप में, मूल DesB गतिविधि और 4 की उपस्थिति में अपनी गतिविधि के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके-nitrocatechol (4NC), एक यौगिक सामांयतः विशेषताएं और dioxygenase एंजाइमों को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया2,17, 18, दिखाया गया है ।
DesB नीचे gallate, एक lignin सुगंधित यौगिक को तोड़ने में सक्षम है, एक extradiol dioxygenase (ईदो) प्रतिक्रिया के माध्यम से जिसमें अंगूठी खोलने सब्सट्रेट10,19में से एक के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग कर catalyzed है । यह एंजाइमी प्रतिक्रिया lignin के टूटने के संदर्भ में होती है, पौधों की कोशिका दीवार में एक खुशबूदार heteropolymer पाया जाता है । Lignin, सुगंधित यौगिकों कि आगे केंद्रीय चयापचयों3,20,21,22,23,24 में टूट सकता है की एक किस्म उपज हो सकता है ,25,26,27,28,29,30,31,३२,३३ . Extradiol dioxygenases (ईदो) उत्प्रेरित dihydroxylated खुशबूदार यौगिकों पर एक अंगूठी खोलने प्रतिक्रिया है, जहां दरार एक धातु-समंवित दिओल से सटे होता है; इसके विपरीत, intradiol dioxygenases दो हाइड्रॉक्सिल समूहों (चित्रा 1) के बीच अनुरूप खुशबूदार यौगिकों सट । EDOs, कई अंय metalloenzymes की तरह, Fe समंवय के लिए एक divalent धातु केंद्र (द्वितीय) एक दो histidine, एक-carboxylate त्रय9,३४,३५से बना है । इन metalloenzymes ऑक्सीकरण हो जाते हैं, या तो autoxidation या तंत्र आधारित निष्क्रियता के माध्यम से, जबकि एंजाइम निष्क्रिय2,३६,३७,३८प्रदान की गई है ।
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में, हम DesB, जीवाणु Sphingobium sp से PCAD superfamily के एक सदस्य का उपयोग । SYK-6, उत्प्रेरित (चित्रा 2a) की C4-C5 बॉन्ड भर में ऑक्सीजन के अलावा gallate । इस क्लीवेज की regiochemistry LigAB के अनुरूप है, जो एक protocatechuate-4, 5-dioxygenase (figure 2बी) है । इस प्रकार अब तक, इस gallate dioxygenase की जांच यौगिकों कि DesB10,19,३९को बाधित की कोई रिपोर्ट शामिल हैं । एरोबिक शुद्धि तरीकों के उपयोग के साथ, DesB चर गतिविधि का प्रदर्शन किया, जबकि anaerobic तरीकों के उपयोग के साथ हम लगातार reproducible गतिविधि के साथ प्रोटीन प्राप्त करने में सक्षम थे । काइनेटिक अध्ययन यहां वर्णित DesB के anaerobic शुद्धि, gallate के साथ DesB की प्रतिक्रिया के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके दिखाने के लिए, और 4 द्वारा DesB के निषेध-nitrocatechol (4NC) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सक्रिय, शुद्ध DesB प्रोटीन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कदम के गठन और कम Fe (द्वितीय) एंजाइम में सक्रिय साइट के बनाए रखने शामिल है । इस तरह के रूप में, प्रेरण, शुद्धि, एकाग्रता के सही प्रदर्शन, और लवण कदम सफलताप…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए Wesleyan विश्वविद्यालय के डॉ केमिली केलर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । प्रोफेसर लिंडसे Eltis और Jenna K Capyk ब्रिटिश कोलंबिया के विश्वविद्यालय से विशेष धंयवाद, साथ ही साथ ईसाई Whitman ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय से, उनकी सलाह के लिए anaerobic प्रोटीन शोधन विधियों के बारे में और एक O 2 का उपयोग -संवेदनशील इलेक्ट्रोड ।
Materials
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
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