Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor anaërobe EiwitReiniging, anaërobe eiwitconcentratie en latere kinetische karakterisering met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. De methode wordt geïllustreerd met behulp van het enzym DesB, een dioxygenase enzym die meer stabiel actief en wanneer gezuiverd en in een anaëroob milieu opgeslagen.
Abstract
Zuurstof-gevoelige eiwitten, met inbegrip van deze enzymen die gebruik maken van de zuurstof als substraat, kunnen stabiliteit wanneer gereinigd met behulp van traditionele aerobic zuivering methoden hebben verminderd. Dit manuscript illustreert de technische details die betrokken zijn bij het zuiveringsproces van anaërobe, met inbegrip van de voorbereiding van reagentia, buffers en de methoden voor kolom-chromatografie in een handschoen vak en het ontzouten van het eiwit vóór kinetiek. Ook beschreven, zijn de methoden voor de voorbereiding en het gebruik van een zuurstof-elektrode voor het uitvoeren van kinetische karakterisering van een enzym dat zuurstof-met behulp van. Deze methodes worden geïllustreerd met behulp van het enzym dioxygenase DesB, een gallate dioxygenase van de bacterie Sphingobium sp. strain Unnethes-6.
Introduction
Enzymen die gebruik maken van ijzer of andere metalen te activeren van zuurstof zijn vaak gevoelig voor inactivering tijdens het zuiveringsproces vanwege hun verwijdering uit de vermindering omgeving van een cel. Daarom deze eiwitten als cel lysates moeten worden gebruikt, onderworpen aan externe reductoren of anaëroob gezuiverd worden om ervoor te zorgen dat zij optimaal enzymatische activiteit1,2,3,4. Voor deze enzymen die is zuurstof-gevoelige (specifiek ijzer-bevattende enzymen), uitvoeren van alle stappen voor de zuivering en karakterisering met behoud van anaërobe omstandigheden noodzakelijk om hen volledig te karakteriseren. Dit heeft ertoe geleid dat onderzoekers te ontwikkelen volledige laboratorium set-ups binnen de grenzen van anaërobe kamers voor studies variërend van eiwit expressie t/m kristallografie5,6,7,8 .
Hierin, rapporteren we methodes voor de anaërobe zuivering en kinetische karakterisering van het enzym DesB met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. DesB is een gallate dioxygenase van de bacterie Sphingobium sp. strain Unnethes-6, die betrekking heeft op LigAB, een dioxygenase van de protocatecuate van het hetzelfde organisme. Beide enzymen behoren tot het type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamilie die heeft niet uitvoerig bestudeerd tot en met datum9, waarschijnlijk deels te wijten aan enzymen van deze superfamilie wordt gevoelig voor inactivering wanneer gereinigd met behulp van standaard aërobe Eiwit zuivering methoden. Aangezien sommigen van de PCAD enzymen substraat promiscuïteit, tonen terwijl anderen substraat-specifieke2,10, verdere is karakterisering van deze superfamilie nodig om te identificeren specificiteit determinanten. Zoals geconstateerd in verschillende enzym superfamilies11,12,13,14,15, kunnen kleine molecules activiteit via directe competitieve remming of de binding van wijzigen moleculen om te scheiden allosteric zakken waardoor een toename of afname van enzymatische activiteit16. Kinetiek alleen kan niet de locatie van de binding van een modulator differentiëren, bepaling van de omvang van een activiteit wijzigen is belangrijk voor het begrijpen van de effecten. Als dergelijke, methoden voor kinetische karakterisering van inheemse DesB activiteit en de activiteit in aanwezigheid van 4-nitrocatechol (4NC), een verbinding die vaak gebruikt om te karakteriseren en remmen dioxygenase enzymen2,17, 18, worden weergegeven.
DesB is in staat te breken gallaat, een aromatische lignine afkomstige samengestelde, via een extradiol dioxygenase (EDO) reactie in die ring opening wordt gekatalyseerd met behulp van zuurstof als één van de substraten10,19. Deze enzymatische reactie treedt op binnen de context van de afbraak van lignine, een aromatische heteropolymer gevonden in de celwand van planten. Lignine kan worden depolymerized, opbrengst van een verscheidenheid aan aromatische verbindingen die kan worden verder onderverdeeld in Centraal metabolieten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyseren een reactie op dihydroxylated aromatische verbindingen, waar decollete grenzend aan een metaal-gecoördineerd diol voorkomt; openen ring in tegenstelling, klieven intradiol dioxygenases analoog aromatische verbindingen tussen de twee hydroxylgroepen (Figuur 1). EDOs, zoals veel andere metalloenzymes, hebben een divalente metalen center voor coördinerende Fe(II) samengesteld uit een twee-histidine, één-carboxylaat triade9,34,35. Deze metalloenzymes worden geoxideerd, via autoxidation of mechanisme gebaseerde inactivatie, overwegende dat het enzym inactief2,36,37,38wordt weergegeven.
In de experimentele procedures die worden beschreven in dit manuscript, gebruiken we DesB, een lid van de PCAD-superfamilie van de bacterie Sphingobium sp. Unnethes-6, te katalyseren van de toevoeging van zuurstof in de C4-C5-band van gallate (figuur 2A). De regiochemistry van deze splitsing is analoog aan LigAB, een protocatechuate-4,5-dioxygenase (figuur 2B). Onderzoek van deze gallate dioxygenase omvatten tot nu toe geen meldingen van stoffen die een remmende werking DesB10,19,39. Met het gebruik van aërobe zuivering methoden tentoongesteld DesB variabele activiteit, terwijl met het gebruik van anaerobe methoden konden we consequent krijgen eiwit met reproduceerbare activiteit. De kinetische studies beschreven hier tonen de methoden voor anaërobe zuivering van DesB, kinetische karakterisering van de reactie van DesB met gallate en de remming van DesB door 4-nitrocatechol (4NC).
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische stappen bij het verkrijgen van actieve, gezuiverde eiwit van het DesB betrekking hebben op de vorming en handhaving van de verminderde Fe(II) actieve site in het enzym. Als zodanig, het corrigeren van prestaties van de inductie, zuivering, concentratie en demineralisatie maatregelen zijn noodzakelijk voor het actieve enzym met succes te verkrijgen. Inducerende eiwituitdrukking in aanwezigheid van 1 mM ferro ammoniumsulfaat, zorgt u ervoor dat de Fe(II) correct is opgenomen in de actieve site van DesB. Deze m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Dr. Camille Keller van Wesleyan University voor technische ondersteuning. Speciale dank aan Professor Lindsay D. Eltis en Jenna K. Capyk van de University of British Columbia, evenals Christian Whitman van de Universiteit van Texas in Austin, voor hun advies over anaërobe eiwit zuivering methoden en het gebruik van een O2 -gevoelige elektrode.
Materials
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
Riferimenti
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochimica. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -. L., Tainer, J. A., David, S. S. . Methods in Enzymology. 599, 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochimica. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochimica. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochimica. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochimica. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
