Analyse af epididymis proteinsyntese og sekretion
Summary
Her rapporterer vi immunofluorescens lokalisering af dynamin til at illustrere protokollerne til påvisning af proteiner i paraffin-embedded mus epididymis sektioner og dem af en udødeliggjort epididymis cellelinje (mECap18). Vi beskriver også protokollerne til isolering af sekretoriske proteiner fra både epididymis væske og konditioneret celle medier.
Abstract
Pattedyr epididymis genererer en af de mest komplekse intraluminal væsker af en endokrin kirtel støtte post testikel modning og opbevaring af sædceller. Sådan kompleksitet opstår på grund af den kombinerede sekretoriske og lydabsorberende aktivitet af epitelceller foring. Her, beskriver vi teknikker til analyse af epididymis proteinsyntese og sekretion af fokus på familien model protein af dynamin (DNM) mechanoenzymes; store GTPases, der har potentiale til at regulere bi-directional membran menneskehandel begivenheder. Til undersøgelse af protein udtryk i epididymis væv beskriver vi robust metode til immunofluorescens mærkning af target proteiner i paraffin-embedded sektioner og den efterfølgende opdagelse af den geografiske fordeling af disse proteiner via immunfluorescens mikroskopi. Vi beskriver også optimeret metoder til isolering og karakterisering af exosome som blærer, kendt som epididymosomes, som udskilles i epididymis lumen til at deltage i intercellulær kommunikation med modning sædceller. Som en supplerende tilgang beskrive vi også immunofluorescens påvisning af target proteiner i cellelinie en SV40-udødeliggjort mus caput epididymis epitel (mECap18). Desuden diskuterer vi nytte af mECap18 cellelinje som egnede in vitro- model til at undersøge regulering af epididymis sekretoriske aktivitet. Til dette formål beskriver vi dyrkningsbaserede kravene til vedligeholdelse af mECap18-cellelinie og anvendelse af selektive farmakologisk hæmning regimer, der er i stand til at påvirke deres sekretoriske proteiner profil. Sidstnævnte er let vurderet via høst af konditioneret næringssubstrat, koncentration af udskilles proteiner via trichloreddikesyre/acetone nedbør og deres efterfølgende analyse via SDS-PAGE og immunoblotting. Vi hævder, at disse kombinerede metoder er velegnet til analyse af alternative epididymis protein mål som en optakt til bestemmelse af deres funktionelle rolle i sæd modning og/eller opbevaring.
Introduction
Sædcellerne af alle pattedyrarter erhverve potentiale til at vise frem progressive motilitet og befrugter en ægcelle under deres langvarig nedstigning gennem epididymis, et højt specialiseret område af den mandlige ekstra testikel kanalsystemet, som kan tage 7-14 dage til at navigere (afhængigt af arter)1. På grund af den ekstreme kondensering af den faderlige kromatin og afgivelse af størstedelen af cytoplasma, der ledsager cytodifferentiation af sædceller i testiklerne, er deres efterfølgende funktionelle modning drevet udelukkende af deres interaktion med den epididymis mikromiljø. Dette miljø er til gengæld lavet af sekretoriske og lydabsorberende aktiviteten af foring epididymis soma og viser en ekstraordinær grad af segment-segment variation1. Således, de mest aktive segmenter i form af proteinsyntese og sekretion er dem, der ligger i den proksimale del af bitestiklen (nemlig caput og corpus)2. Denne aktivitet afspejler den funktionelle profil af sædceller, med celler først begynder at vise kendetegnende for funktionel kompetence (dvs., progressive motilitet og evnen til at binde til syre-solubilized zona glykoproteiner) følgende deres passage gennem caput epididymis3. Disse funktionelle attributter fortsætte med at udvikle før at nå optimale niveauer, som sæden nå den distale epididymis segment (cauda), hvori de er gemt i en inaktiv tilstand i beredskab til sædafgang. Dannelsen og vedligeholdelse af denne sæd opbevaring reservoir er også nært knyttet til foring epitel, som i cauda er domineret af stærkt absorberende aktivitet4,5. Selv om anatomiske forskelle har været rapporteret6,7,8, synes sådan regionaliseret arbejdsdeling at være karakteristisk for epididymis, der er delt blandt fleste pattedyr arter studerede til dato, herunder vores egen9,10. Faktisk, fra et klinisk perspektiv, er det kendt, at epididymis dysfunktion er et vigtigt bidrag til ætiologien af mandlige faktor barnløshed11, hvilket understreger vigtigheden af at forstå reguleringen af denne specialiserede væv.
Det er derfor beklageligt, at vores forståelse af epididymis fysiologi, og de mekanismer, der regulerer de fortløbende faser af sperm modning og opbevaring i dette væv, mangler for at blive helt løst. Blandt de medvirkende faktorer er begrænsende fremskridt i epididymis forskning den samlede kompleksitet af dette væv og viden om de mekanismer, der udøver regulerende kontrol over sin luminale mikromiljø. Anatomisk, ved vi, at ud over skelnen af caput, corpus og cauda segmenter, epididymis kan yderligere opdeles i flere zoner (figur 1A), hver adskilt af septa12 og karakteriseret ved diskrete profiler af gen/protein udtrykket13,14,15,16,17,18. Ja, på grundlag af detaljerede transcriptional profilering af segmental genekspression i epididymis, så mange som 6 og 9 forskellige epididymis zoner er blevet rapporteret i mus og rotter-modeller, henholdsvis19,20. Sådan kompleksitet formentlig afspejler sammensætningen af de epididymis soma, en pseudostratified epitel, der består af mange forskellige celletyper; hver forskellige med hensyn til deres overflod, distribution og sekretoriske/lydabsorberende aktiviteter langs længden af tarmkanalen. Principal celler er således langt den mest rigelige epididymis celle type udgør op mod 80% af alle epitelceller. I overensstemmelse hermed, principal celler er ansvarlige for størstedelen af epididymis protein biosyntese og sekretion5. Derimod er klart celle befolkning, der rangerer som den anden mest rigelige celletype i epididymis soma, primært involveret i selektive absorption af luminale komponenter og forsuring af denne mikromiljø5. Tilføje endnu et lag af kompleksitet, udøve androgener og andre lumicrine faktorer testikel hjemlandene differentieret kontrol over hver af disse epididymis celletyper alt efter deres placering langs tarmkanalen.
Trods de begrænsninger af sådanne kompleksitet fortsat betydelige indhug gøres til løse mekanistiske grundlaget for epididymis funktion. En nøgle til disse undersøgelser har været anvendelsen af avancerede massespektrometri strategier at etablere brede skala opgørelser af epididymis proteomet, sammen med detaljerede analyser af individuelle proteiner udvalgt blandt disse indledende undersøgelser. En illustration af denne tilgang er vores seneste karakterisering af DNM familie af mechanoenzymes i mus model21. Vores indledende interesse i DNM blev næret af dets dual action i koblingen af exo- og endocytotic processer. Med udgangspunkt i disse observationer, var vi i stand til at demonstrere at de tre kanoniske isoformer af DNM (DNM1 – DNM3) er stærkt udtrykt i mus epididymis og korrekt placeret for at opfylde lovgivningsmæssige roller i protein sekretion og absorption21 . Desuden, vi har kunnet skelne klart mellem hver DNM isoform på grundlag af deres cellulære og subcellulære lokalisering, hvilket tyder på at de besidder supplerer hinanden, i stedet for redundant, aktivitet inden for epididymis epitel21.
Her beskriver vi de eksperimentelle metodologi til undersøgelse af DNM udtryk i mus epididymis med håbet om, at disse oplysninger vil finde større anvendelse i karakterisering af alternative epididymis proteiner og dermed bidrage til vores forståelsen af funktionen af denne vigtige del af den mandlige forplantningskanal. Specifikt, beskriver vi udviklingen af robust metode til immunofluorescens mærkning af target proteiner i paraffin-embedded epididymis sektioner og den efterfølgende opdagelse af den geografiske fordeling af disse proteiner via immunfluorescens mikroskopi. Vi yderligere dokumentere vores seneste optimerede protokoller22 til isolering og karakterisering af epididymosomes; lille exosome-lignende blærer, der udgør centrale elementer i epididymis sekretoriske profilen og synes at holde en fremtrædende rolle i at fremme sædceller modning23. Som en supplerende tilgang beskrive vi også immunofluorescens påvisning af target proteiner i cellelinie en udødeliggjort mus caput epididymis epitel (mECap18) og anvendelsen af denne ressource som en model til at undersøge regulering af epididymis sekretoriske aktivitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disse undersøgelser indgår brugen af Bouins faste epididymis væv, der havde været udsat for paraffin indlejring og skære standardprotokoller. Bouins Fikseringsvæske løsning består af en blanding af formaldehyd, picrinsyre syre og eddikesyre, med hver komponent har en specifik og supplerende funktion. Således formaldehyd reagerer med primære aminer til at danne protein cross-links, picrinsyre syre trænger langsomt væv danner salte og dermed koagulation af grundlæggende proteiner og omvendt, eddikesyre hurtigt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende National sundhed og Medical Research Rådet af Australien Project Grant APP1103176 til støtte for dette arbejde.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Riferimenti
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf’s thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell’Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
