Analyse van epididymaire eiwitsynthese en afscheiding
Summary
Wij rapporteren hier, de lokalisatie van de immunofluorescentietest voor dynamin ter illustratie van de protocollen voor de detectie van eiwitten in paraffine-ingebedde muis epididymaire secties en die van een vereeuwigd epididymaire cellijn (mECap18). Ook beschrijven we de protocollen voor de isolatie van proteïnen van de secretoire van zowel epididymaire vloeistof en geconditioneerde cel media.
Abstract
De zoogdieren bijbal genereert een van de meest complexe intraluminale vloeistoffen van een endocriene klier ter ondersteuning van de post-testiculaire rijping en opslag voor spermacellen. Dergelijke complexiteit ontstaat als gevolg van de gecombineerde secretoire en absorberend activiteit van de epitheliale cellen van de voering. Hier beschrijven we de technieken voor de analyse van epididymaire eiwitsynthese en secretie door zich te concentreren op het eiwit modelgezin van dynamin (DNM) mechanoenzymes; grote GTPases die de potentie hebben om reguleren bi-directionele membraan mensenhandel gebeurtenissen. Voor de studie van eiwit expressie in epididymaire weefsel beschrijven wij robuuste methodologie voor het labelen van de immunofluorescentie doel eiwitten in paraffine-ingebedde secties en de daaropvolgende opsporing van de ruimtelijke spreiding van deze eiwitten via immunofluorescentie microscopie. Ook beschrijven we geoptimaliseerde methodologie voor de isolatie en de karakterisering van exosome zoals blaasjes, bekend als epididymosomes, die worden uitgescheiden in de epididymaire lumen deelnemen aan intercellulaire communicatie met de rijping van de zaadcellen. Als een complementaire aanpak beschrijven we ook de immunofluorescentie detectie van doel eiwitten in een cellijn SV40-vereeuwigd muis caput epididymaire epitheliale (mECap18). Bovendien bespreken we het nut van de mECap18 cellijn als een model geschikt in vitro met voor het verkennen van de regulering van epididymaire secretoire activiteit. Voor dit doel beschrijven we de kweken eisen voor het onderhoud van de cellijn van mECap18 en het gebruik van selectieve farmacologische remming regimes die kunnen beïnvloeden hun secretoire eiwit-profiel. De laatste zijn beoordeeld gemakkelijk via het oogsten van geconditioneerde kweekmedium, concentratie van proteïnen toe secreted via trichloorazijnzuur/aceton neerslag en hun latere analyse via de SDS-pagina en immunoblotting. Wij betogen dat deze gecombineerde methoden geschikt voor de analyse van alternatieve epididymaire eiwit doelstellingen als een prelude zijn op de bepaling van hun functionele rol in de rijping van de zaadcellen en/of opslag.
Introduction
De spermacellen van alle soorten zoogdieren verwerven de mogelijkheden om weer vooruit progressieve mobiliteit te geven en om een eicel te bevruchten tijdens hun langdurige afdaling via de bijbal, een zeer gespecialiseerde gebied van de mannelijke extra testiculaire kanaalsysteem, die kan 7-14 dagen om te navigeren (afhankelijk van de soort)1. Als gevolg van de extreme condensatie van de chromatine vaderlijke en het vergieten van de meerderheid van het cytoplasma die hoort bij de cytodifferentiation van spermacellen in de teelballen, wordt hun latere functionele rijping gedreven uitsluitend door hun interactie met de epididymaire communicatie. Dit milieu is, op zijn beurt, gemaakt door de secretoire en absorberend activiteit van de voering epididymaire soma en geeft een uitzonderlijke niveau van segment-segment variatie1. Dus, de meest actieve segmenten op het gebied van de eiwitsynthese en secretie zijn gelegen in het proximale deel van de bijbal (namelijk, de caput en corpus)2. Deze activiteit komt overeen met de functionele Profiel van spermatozoïden, met het eerste begin van de cellen weer te geven van de kenmerken van functionele bevoegdheid (dwz., progressieve mobiliteit en het vermogen om te binden aan zuur-ontbindend zona glycoproteïnen) volgende hun passage door het caput bijbal3. Deze functionele kenmerken blijven ontwikkelen vóór het bereiken van optimale niveaus als de zaadcellen de distale epididymaire segment (cauda) bereiken, waarin ze zijn opgeslagen in een rustige staat in gereedheid voor de ejaculatie. De vorming en het onderhoud van dit sperma opslag reservoir is ook nauw verbonden met de voering epitheel, die in de cauda wordt gedomineerd door sterke absorberend activiteit4,5. Hoewel anatomische verschillen gerapporteerde6,7,8 geweest, lijkt dergelijke regionale verdeling van de arbeid te zijn een kenmerk van de bijbal die wordt gedeeld door de meerderheid van de soorten zoogdieren studeerde tot nu toe, met inbegrip van onze eigen9,10. Inderdaad, vanuit klinisch oogpunt, het is bekend dat epididymaire dysfunctie levert een belangrijke bijdrage aan de etiologie van mannelijke factor onvruchtbaarheid11, dus wijzen op het belang van inzicht in de regulering van deze gespecialiseerde weefsel.
Het is daarom betreurenswaardig dat ons begrip van epididymaire fysiologie, en de mechanismen die de opeenvolgende fasen van rijping van de zaadcellen en opslag binnen dit weefsel, reguleren blijven worden volledig opgelost. De bijdragende factoren behoren beperkende voorschotten in epididymaire onderzoek tot de algehele complexiteit van dit weefsel en kennis van de mechanismen die het uitoefenen van regelgevende controle over haar luminal communicatie. Anatomisch, weten we dat buiten het onderscheid van caput, corpus en cauda segmenten, de bijbal kan verder worden onderverdeeld in verschillende zones (figuur 1A), elk gescheiden door septa12 en gekenmerkt door aparte profielen van gene/eiwit expressie13,14,15,16,17,18. Inderdaad, op basis van gedetailleerde transcriptionele profilering van gesegmenteerde genexpressie in de bijbal, maar liefst 6 en 9 verschillende epididymaire zones zijn gemeld in de muis en rat modellen, respectievelijk19,20. Dergelijke complexiteit vermoedelijk weerspiegelt de samenstelling van de epididymaire soma, een pseudostratified epitheel bestaat uit talrijke verschillende soorten cellen; elke verschillen met betrekking tot hun overvloed, distributie en secretoire/absorberend activiteiten langs de lengte van het darmkanaal. Belangrijkste cellen zijn dus veruit de meest voorkomende epididymaire cel type vormen meer dan 80% van alle epitheliale cellen. Dienovereenkomstig, belangrijkste cellen zijn verantwoordelijk voor het grootste deel van epididymaire eiwit biosynthese en secretie5. Daarentegen zijn de cel wissen bevolking, die gerangschikt als de tweede meest voorkomende celtype binnen de epididymaire soma, voornamelijk betrokken bij selectieve absorptie van luminal componenten en de verzuring van deze communicatie-5. Een andere laag van complexiteit toe te voegen, uitoefenen androgenen en andere lumicrine factoren van testiculaire oorsprong differentiële controle over elk van deze epididymaire celtypes afhankelijk van hun plaats langs de tractus.
Ondanks de beperkingen opgelegd door dergelijke complexiteit, blijven belangrijke inbreuk worden gemaakt in het oplossen van de mechanistische basis van epididymaire functie. Een sleutel tot deze studies is de toepassing van geavanceerde massaspectrometrie strategieën om grootschalige voorraden van de epididymaire Proteoom, samen met gedetailleerde analyses van individuele eiwitten gekozen uit deze eerste onderzoeken geweest. Een illustratie van deze benadering is onze recente karakterisering van de DNM-familie van mechanoenzymes in de muis model21. Onze eerste interesse in DNM werd aangewakkerd door haar dubbele werking in de koppeling van exo- en endocytotic processen. Voortbouwend op deze opmerkingen, konden we aantonen dat de drie canonieke isoforms van DNM (DNM1 – DNM3) zijn sterk in de bijbal muis uitgedrukt en op de juiste manier gepositioneerd om te voldoen aan regelgeving rollen in eiwit secretie en absorptie21 . Bovendien konden we duidelijk onderscheid elke DNM-isovorm op basis van hun cellulaire en sub cellulaire lokalisatie, dus suggereren dat zij elkaar aanvullen, in tegenstelling tot de redundante, activiteit binnen de epididymaire epitheel-21bezitten.
Hier beschrijven we de experimentele methodologie werkzaam voor de studie van DNM expressie in de bijbal muis met de hoop dat deze informatie zal ruimere toepassing in de karakterisering van alternatieve epididymaire eiwitten vinden en aldus bijdragen aan onze inzicht in de functie van dit belangrijke element van het mannelijk voortplantingssysteem. Specifiek, beschrijven we de ontwikkeling van robuuste methodologie voor het labelen van de immunofluorescentie doel eiwitten in paraffine-ingebedde epididymaire secties en de daaropvolgende opsporing van de ruimtelijke spreiding van deze eiwitten via immunofluorescentie microscopie. Documenteren we verder onze onlangs geoptimaliseerde protocollen22 voor de isolatie en de karakterisering van epididymosomes; kleine exosome-achtige blaasjes die vormen belangrijke elementen van het epididymaire secretoire profiel en lijken te houden een prominente rol bij de bevordering van sperma rijping23. Als een complementaire aanpak beschrijven we ook de immunofluorescentie detectie van doel eiwitten in een cellijn vereeuwigd muis caput epididymaire epitheliale (mECap18) en het gebruik van deze hulpbron als een model om te verkennen van de regulering van de epididymaire secretoire activiteit in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studies opgenomen het gebruik van Bouin van vaste epididymaire weefsel dat paraffine insluiten en vectorafbeeldingsbestanden standaardprotocollen had ondergaan. Bouin van kleefpoeders oplossing bestaat uit een mengsel van formaldehyde, picrinezuur en azijnzuur, met elke component die een specifieke en complementaire functie hebben. Dus, formaldehyde reageert met primaire amines vormen van eiwit cross-links pikrinezuur langzaam dringt het weefsel zouten vormen en vandaar stolling van fundamentele eiwitten en omgekeer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad van Australië Project Grant APP1103176 ter ondersteuning van dit werk.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Riferimenti
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf’s thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell’Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
