Analyse der Epididymal Protein-Synthese und Sekretion
Summary
Hier berichten wir über die Immunfluoreszenz-Lokalisierung von Dynamin, die Protokolle für den Nachweis von Proteinen in Paraffin-eingebetteten Maus epididymal Abschnitten und derjenigen einer epididymal immortalisierte Zelllinie (mECap18) zu illustrieren. Wir beschreiben auch die Protokolle für die Isolierung von sekretorischen Proteine aus epididymal Flüssigkeit und konditionierten Zelle Medien.
Abstract
Der Säugetier-Nebenhoden erzeugt eines der komplexesten Intraluminal Flüssigkeiten endokrine Drüse um die Post-Hoden Reifung und Lagerung von Spermien zu unterstützen. Diese Komplexität entsteht aufgrund der kombinierten sekretorischen und absorptive Aktivität der epithelialen Zellen Futter. Hier beschreiben wir die Techniken für die Analyse der epididymal Protein-Synthese und Sekretion durch die Konzentration auf die Modell-Protein-Familie von Dynamin (DNM) Mechanoenzymes; großen GTPasen, die das Potenzial haben, Bi-direktionale Membran Menschenhandel Veranstaltungen zu regulieren. Für die Untersuchung von Protein-Expression in epididymal Gewebe beschreiben wir robuste Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Wir beschreiben auch optimierte Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von exosom wie Bläschen, bekannt als Epididymosomes, die in der epididymal Lumen zur Teilnahme an interzelluläre Kommunikation mit Reifen Spermien abgegeben werden. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie SV40 verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18). Darüber hinaus diskutieren wir den Nutzen der mECap18 Zelle als geeignete in-vitro- Modell mit, um die Regulierung der epididymal sekretorischen Aktivität zu erkunden. Zu diesem Zweck beschreiben wir die Kultivierung Anforderungen für die Aufrechterhaltung der mECap18-Zell-Linie und der Einsatz von selektiven pharmakologische Hemmung Regimen, die ihre sekretorischen Protein Profil zu beeinflussen können. Letztere werden bewertet ohne weiteres über die Ernte der konditionierten Kulturmedium, Konzentration der sekretierten Proteine über Trichloressigsäure Säure/Aceton Niederschlag und ihre anschließende Analyse über die SDS-PAGE und Immunoblotting. Wir behaupten, dass diese kombinierte Methoden für die Analyse von alternativen epididymal Protein-Targets als Auftakt zur Bestimmung ihrer funktionalen Rolle in spermienreifung und/oder Lagerung eignen.
Introduction
Die Spermien von allen Säugetierarten erwerben das Potenzial um vorwärts progressive Motilität anzuzeigen und eine Eizelle befruchten während ihrer längeren Abstieg durch die Nebenhoden, eine hoch spezialisierte Region des männlichen extra Hoden Kanalsystems, die 7-14 Tage (abhängig von der Sorte) navigieren1. Durch die extreme Kondensation des Chromatins väterlicherseits und das Ablösen von der Mehrheit der Zytoplasma, die die Cytodifferentiation der Spermien im Hoden begleitet, wird ihre nachfolgenden funktionellen Reifung ausschließlich durch ihre Interaktion angetrieben. mit der epididymal Mikroumgebung. Dieses Milieu entsteht wiederum durch die sekretorischen und absorptive Aktivität der Auskleidung epididymal Soma und zeigt ein außergewöhnliches Maß an Segment-Segment Variante1. So sind die meisten aktiven Segmente in Bezug auf die Protein-Synthese und Sekretion im proximalen Teil des Nebenhodens (nämlich die Caput und Korpus)2. Diese Tätigkeit spiegelt das funktionale Profil von Spermien, mit dem Zellen ersten anzuzeigenden Markenzeichen der fachliche Kompetenz (i.e., progressive Motilität und die Fähigkeit zur Bindung an Säure solubilisiert Zona Glykoproteine) folgende ihre Durchgang durch das Caput Nebenhoden3. Diese funktionelle Attribute weiter ausbauen vor dem optimalen Niveau zu erreichen, wie das Sperma der distalen epididymal Segment (Cauda), erreichen wobei sie im Ruhezustand in Bereitschaft zur Ejakulation gespeichert sind. Bildung und Erhaltung von diesem Sperma-Lagerung-Reservoir ist auch eng mit der Auskleidung Epithel, die in der Cauda dominiert wird von starken absorptive Aktivität4,5verbunden. Anatomische Unterschiede gemeldeten6,7,8gewesen, scheint solche regionalisierte Arbeitsteilung ein Merkmal des Nebenhodens zu sein, die bei der Mehrheit der Säugetierarten geteilt wird studierte bis Datum, einschließlich unserer eigenen9,10. In der Tat aus klinischer Sicht ist es bekannt, dass epididymal Dysfunktion leistet einen wichtigen Beitrag zur Ätiologie von männlicher Faktor Unfruchtbarkeit11, also Hervorhebung der Bedeutung die Verordnung dieses spezialisierte Gewebe zu verstehen.
Es ist daher bedauerlich, dass unser Verständnis der epididymal Physiologie und die Mechanismen, die die aufeinander folgenden Phasen der spermienreifung und Lagerung in diesem Gewebe zu regulieren nicht vollständig gelöst werden. Unter den beitragenden Faktoren sind limitierende Fortschritte in der epididymal Forschung der Komplexität dieses Gewebes und Wissen über die Mechanismen, die regulatorischen Kontrolle über seine luminalen Mikroumgebung ausüben. Anatomisch, wissen wir, dass über die Unterscheidung von Caput, Korpus und Cauda Segmente, die Nebenhoden kann weiter unterteilt werden in mehrere Zonen (Abbildung 1A), die jeweils getrennt durch Septen12 und zeichnet sich durch diskrete profile gen/Protein Ausdruck13,14,15,16,17,18. In der Tat, wurden auf der Grundlage von detaillierten transkriptionelle Profilierung der segmentalen Genexpression in den Nebenhoden, weniger als 6 und 9 verschiedene epididymal Zonen in der Maus und Ratte Modelle, bzw.19,20gemeldet. Diese Komplexität spiegelt vermutlich die Zusammensetzung der epididymal Soma, eine pseudostratified Epithel, bestehend aus zahlreichen verschiedenen Zelltypen; Jede abweichende in Bezug auf ihre Fülle, Verteilung und sekretorischen/absorptive Aktivitäten entlang der Länge des Traktes. Wichtigsten Zellen sind also bei weitem die am häufigsten vorkommende epididymal Zelle Art bilden mehr als 80 % aller epithelialen Zellen. Dementsprechend sind die wichtigsten Zellen verantwortlich für den Großteil der epididymal Protein Biosynthese und Sekretion5. Im Gegensatz dazu sind die klare Zellpopulation, die Rang als die zweithäufigste Zelltyp innerhalb der epididymal Soma in erster Linie selektive Absorption der luminalen Komponenten und die Versauerung der Mikroumgebung5beteiligt. Hinzufügen einer anderen Ebene der Komplexität, üben Androgene und andere Lumicrine Faktoren der Hoden Herkunft differenzielle Kontrolle über jedes dieser epididymal Zelltypen abhängig von ihrer Positionierung entlang den Trakt.
Trotz der Beschränkungen durch diese Komplexität auch weiterhin bedeutende Überfälle in die mechanistische Grundlage der epididymal Funktion zu lösen. Ein Schlüssel zu diesen Studien wurde die Anwendung der erweiterten Massenspektrometrie Strategien auf breiter Ebene Vorräte des epididymal Proteome im Tandem mit detaillierten Analysen der einzelnen Proteine ausgewählt aus dieser ersten Umfragen zu etablieren. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist unsere jüngste Charakterisierung der DNM-Familie der Mechanoenzymes in der Maus Modell21. Unsere anfängliche Interesse an DNM wurde durch seine doppelte Wirkung in der Kupplung von Exo- und endocytotic Prozessen angetrieben. Aufbauend auf diesen Beobachtungen, konnten wir beweisen, dass die drei kanonischen Isoformen von DNM (DNM1 – DNM3) sind hoch in der Maus Nebenhoden ausgedrückt und entsprechend positioniert, um regulatorische Rollen in Protein Sekretion und Absorption21 . Darüber hinaus konnten wir deutlich unterscheiden jedes DNM Isoform auf der Grundlage ihrer zellulären und subzellulären Lokalisation hindeutet, dass sie einander ergänzen, im Gegensatz zu redundanten, Aktivität innerhalb der epididymal Epithel21besitzen.
Hier beschreiben wir die experimentelle Methodik beschäftigt für die Untersuchung von DNM Ausdruck in der Maus Nebenhoden mit der Hoffnung, dass diese Informationen wird in der Charakterisierung der alternative epididymal Proteine breitere Anwendung zu finden und tragen so zu unserer Verständnis der Funktion dieses wichtige Element der männlichen Fortpflanzungsorgane. Im einzelnen beschreiben wir die Entwicklung von robusten Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten epididymal Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz Mikroskopie. Weiter dokumentieren wir unsere kürzlich optimierte Protokolle22 für die Isolierung und Charakterisierung von Epididymosomes; kleinen exosom-wie Bläschen, die Schlüsselelemente des epididymal sekretorischen Profils und eine herausragende Rolle bei der Förderung der Spermien Reifung23zu halten scheinen. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18) und der Umgang mit dieser Ressource als ein Modell mit, um die Regulierung der epididymal zu erkunden sekretorischen Aktivität in Vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studien integriert den Einsatz von Bouins festen epididymal Gewebe, das Paraffin einbetten und strukturierendes Standardprotokolle unterzogen hatte. Bouins Fixativ Lösung besteht aus einer Mischung von Formaldehyd, Pikrinsäure und Essigsäure, bei jeder Komponente mit einer spezifischen und ergänzende Funktion. So Formaldehyd reagiert mit primären Aminen Protein Querverbindungen zu bilden, Pikrinsäure langsam durchdringt das Gewebe Salze bilden und somit Koagulation von grundlegenden Proteine und umgekehrt, Es…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die nationale Gesundheit und medizinische Forschung Rat von Australien Project Grant APP1103176 für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Riferimenti
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