यहां, हम dynamin के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण की रिपोर्ट के लिए तेल में प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल-एंबेडेड माउस epididymal वर्गों और एक अमर epididymal सेल लाइन (mECap18) के उन वर्णन । हम भी दोनों epididymal द्रव और वातानुकूलित सेल मीडिया से स्रावी प्रोटीन के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन ।
स्तनधारी अधिवृषण के बाद वृषण परिपक्वता और शुक्राणु के भंडारण का समर्थन करने के लिए किसी भी अंत में स्रावी ग्रंथि के सबसे जटिल intraluminal तरल पदार्थ में से एक उत्पंन करता है । ऐसी जटिलता अस्तर उपकला कोशिकाओं के संयुक्त स्रावी और अवशोषण गतिविधि के कारण पैदा होती है. यहां, हम dynamin (DNM) mechanoenzymes के मॉडल प्रोटीन परिवार पर ध्यान केंद्रित करके epididymal प्रोटीन संश्लेषण और स्राव के विश्लेषण के लिए तकनीकों का वर्णन; बड़े GTPases कि द्वि-दिशात्मक झिल्ली तस्करी की घटनाओं को विनियमित करने की क्षमता है । epididymal ऊतक में प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए, हम आयल-एंबेडेड वर्गों में लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग और इन प्रोटीन के द्वारा स्थानिक वितरण के बाद का पता लगाने के लिए मजबूत कार्यप्रणाली का वर्णन इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी. हम भी अलगाव और बुलबुले की तरह exosome के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित पद्धति का वर्णन, epididymosomes, जो epididymal लुमेन में स्रावित कर रहे है के रूप में जाना जाता है परिपक्व शुक्राणु कोशिकाओं के साथ सेलुलर संचार में भाग लेने के लिए । एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम भी एक SV40-अमर माउस कैपुट epididymal उपकला (mECap18) सेल लाइन में लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने का वर्णन. इसके अलावा, हम mECap18 सेल लाइन की उपयोगिता के रूप में एक उपयुक्त इन विट्रो मॉडल जिसके साथ epididymal स्रावी गतिविधि के विनियमन का पता लगाने के लिए चर्चा । इस प्रयोजन के लिए, हम mECap18 सेल लाइन के रखरखाव के लिए संवर्धन आवश्यकताओं का वर्णन और चुनिंदा औषधीय अवरोधक परहेजों है कि उनके स्रावी प्रोटीन प्रोफ़ाइल को प्रभावित करने में सक्षम है का उपयोग करें । बाद आसानी से कंडीशन्ड संस्कृति माध्यम की कटाई के द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं, trichloroacetic एसिड के माध्यम से स्रावित प्रोटीन की एकाग्रता/एसीटोन वर्षण और एसडीएस के माध्यम से उनके बाद के विश्लेषण-पृष्ठ और immunoblotting । हम तर्क है कि इन संयुक्त तरीकों वैकल्पिक epididymal प्रोटीन लक्ष्य के विश्लेषण के लिए शुक्राणु परिपक्वता में अपने कार्यात्मक भूमिका निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है और/
सभी स्तनधारी प्रजातियों के शुक्राणु आगे प्रगतिशील गतिशीलता प्रदर्शित करने के लिए और अधिवृषण, पुरुष अतिरिक्त वृषण वाहिनी प्रणाली है, जो मई के एक अति विशिष्ट क्षेत्र के माध्यम से अपने लंबे समय तक वंश के दौरान एक डिंब निषेचन के लिए क्षमता प्राप्त ले 7-14 दिन नेविगेट करने के लिए (प्रजातियों पर निर्भर करता है)1। पैतृक क्रोमेटिन के चरम संघनित्र और कोशिका द्रव्य के बहुमत के छप्पर के कारण है कि परीक्षण के भीतर शुक्राणु के cytodifferentiation के साथ, उनके बाद कार्यात्मक परिपक्वता उनकी बातचीत के द्वारा विशेष रूप से संचालित है साथ epididymal microenvironment । इस वातावरण है, बारी में, अस्तर epididymal सोमा के स्रावी और अवशोषण गतिविधि के द्वारा बनाई गई है और खंड खंड भिंनता1का एक असाधारण स्तर प्रदर्शित करता है । इस प्रकार, प्रोटीन संश्लेषण और स्राव के संदर्भ में सबसे सक्रिय क्षेत्रों अधिवृषण के समीपस्थ भाग में स्थित उन हैं (अर्थात्, कैपुट और कोष)2. इस गतिविधि शुक्राणु के कार्यात्मक प्रोफ़ाइल दर्पण, पहले कार्यात्मक क्षमता (यानी, प्रगतिशील गतिशीलता और एसिड को बांध करने की क्षमता-solubilized zona नच) की पहचान प्रदर्शित करने के लिए शुरू की कोशिकाओं के साथ उनके निंनलिखित कैपुट अधिवृषण3के माध्यम से पारित । इन कार्यात्मक विशेषताओं के रूप में शुक्राणु के बाहर epididymal खंड (cauda) तक पहुंचने के लिए इष्टतम स्तर तक पहुंचने से पहले विकसित करने के लिए जारी है, जिसमें वे हांक के लिए तत्परता में एक quiescent राज्य में जमा हो जाती है । गठन और इस शुक्राणु भंडारण जलाशय के रखरखाव भी परिचित अस्तर उपकला है, जो cauda में मजबूत अवशोषण गतिविधि4,5का प्रभुत्व है से बंधा है । हालांकि संरचनात्मक मतभेद6,7,8, श्रम के ऐसे क्षेत्रीय विभाजन रिपोर्ट किया गया है अधिवृषण कि स्तनधारी प्रजातियों के बहुमत के बीच साझा किया जाता है की एक विशेषता प्रतीत होता है हमारे अपने9,10सहित, आज तक का अध्ययन किया । वास्तव में, एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, यह ज्ञात है कि epididymal शिथिलता पुरुष कारक11बांझपन के एटियलजि के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान देता है, इस प्रकार इस विशेष ऊतक के विनियमन को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला ।
इसलिए यह अफसोस की बात है कि epididymal शरीर क्रिया विज्ञान की हमारी समझ है, और तंत्र है कि शुक्राणु परिपक्वता और इस ऊतक के भीतर भंडारण के क्रमिक चरणों को विनियमित, रहने के लिए पूरी तरह से हल हो । योगदान कारक के अलावा, epididymal अनुसंधान में अग्रिम सीमित इस ऊतक और तंत्र है कि अपनी चमकदार microenvironment पर विनियामक नियंत्रण डालती के ज्ञान की समग्र जटिलता है । Anatomically, हम जानते है कि कैपुट, कोष और cauda क्षेत्रों के भेद से परे, अधिवृषण आगे कई क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है (आंकड़ा 1a), प्रत्येक सेपता12 द्वारा अलग और जीन के असतत प्रोफाइल/ अभिव्यक्ति१३,१४,१५,१६,१७,१८. दरअसल, अधिवृषण में खंड जीन अभिव्यक्ति की विस्तृत transcriptional रूपरेखा के आधार पर, के रूप में कई के रूप में 6 और 9 अलग epididymal क्षेत्रों माउस और चूहे के मॉडल में सूचित किया गया है, क्रमशः19,20। इस तरह की जटिलता संभवतः epididymal सोमा, एक pseudostratified उपकला कई अलग सेल प्रकार शामिल की संरचना को दर्शाता है; प्रत्येक उनके बहुतायत, वितरण और स्रावी/अवशोषण गतिविधियों के संबंध में पथ की लंबाई के साथ भिंन । इस प्रकार, प्रमुख कोशिकाओं द्वारा अब तक सबसे प्रचुर epididymal कोशिका प्रकार सभी उपकला कोशिकाओं के ८०% की ऊपर की ओर का गठन कर रहे हैं. तदनुसार, प्रमुख कोशिकाओं epididymal प्रोटीन के थोक के लिए जिंमेदार है और संश्लेषण5स्राव । इसके विपरीत, स्पष्ट सेल जनसंख्या, जो epididymal सोमा के भीतर दूसरी सबसे प्रचुर कोशिका प्रकार के रूप में रैंक, मुख्य रूप से चमकदार घटकों के चयनात्मक अवशोषण में शामिल है और इस microenvironment5के अंलीकरण । जटिलता का एक और स्तरीय जोड़ने, एण्ड्रोजन और वृषण मूल के अन्य lumicrine कारकों पथ के साथ उनकी स्थिति के आधार पर इन epididymal कोशिका प्रकार के प्रत्येक पर विभेदक नियंत्रण डालती.
ऐसी जटिलता द्वारा लगाए गए सीमाओं के बावजूद, महत्वपूर्ण सड़कों epididymal समारोह के यंत्रवत आधार को हल करने में किया जाना जारी है । इन अध्ययनों के लिए एक महत्वपूर्ण उंनत जन स्पेक्ट्रोमेट्री रणनीतियों के आवेदन के लिए epididymal proteome की व्यापक पैमाने पर सूची की स्थापना की गई है, मिलकर व्यक्तिगत इन प्रारंभिक सर्वेक्षणों के बीच से चयनित प्रोटीन का विस्तृत विश्लेषण के साथ । इस दृष्टिकोण का एक उदाहरण हमारे माउस मॉडल21में mechanoenzymes के DNM परिवार के हाल के लक्षण वर्णन है । हमारे DNM में प्रारंभिक ब्याज exo के युग्मन में अपनी दोहरी कार्रवाई के द्वारा ईंधन था-और endocytotic प्रक्रियाओं । इन टिप्पणियों पर निर्माण, हम प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि DNM के तीन विहित isoforms (DNM1-DNM3) अत्यधिक माउस अधिवृषण में व्यक्त कर रहे हैं और उचित रूप से प्रोटीन स्राव और अवशोषण में विनियामक भूमिकाओं को पूरा करने के लिए तैनात21 . इसके अलावा, हम स्पष्ट रूप से अपने सेलुलर और उप सेलुलर स्थानीयकरण के आधार पर प्रत्येक DNM isoform अंतर करने में सक्षम थे, इस प्रकार सुझाव है कि वे पूरक अधिकारी, के रूप में निरर्थक के खिलाफ, epididymal उपकला21के भीतर गतिविधि ।
यहां, हम प्रायोगिक अधिवृषण में DNM अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए कार्यरत पद्धति का वर्णन आशा है कि इस जानकारी के साथ वैकल्पिक epididymal प्रोटीन के लक्षण वर्णन में व्यापक आवेदन मिल जाएगा और इस तरह हमारे योगदान पुरुष प्रजनन पथ के इस महत्वपूर्ण तत्व के समारोह की समझ । विशेष रूप से, हम तेल-एंबेडेड epididymal वर्गों में लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से इन प्रोटीन के स्थानिक वितरण के बाद का पता लगाने के लिए मजबूत पद्धति के विकास का वर्णन माइक्रोस्कोपी. हम आगे अलगाव और epididymosomes के लक्षण वर्णन के लिए अपने हाल ही में अनुकूलित प्रोटोकॉल22 दस्तावेज़; छोटे exosome-बुलबुले कि epididymal स्रावी प्रोफ़ाइल के प्रमुख तत्वों का गठन और शुक्राणु परिपक्वता23को बढ़ावा देने में एक प्रमुख भूमिका पकड़ प्रकट की तरह । एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम भी एक नश्वर माउस कैपुट epididymal उपकला (mECap18) सेल लाइन और जिसके साथ epididymal के विनियमन का पता लगाने के लिए एक मॉडल के रूप में इस संसाधन के उपयोग में लक्ष्य प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने का वर्णन स्रावी गतिविधि इन विट्रो में।
ये अध्ययन है Bouin तय epididymal ऊतक कि आयल embedding और मानक अनुभाग प्रोटोकॉल के अधीन किया गया था के उपयोग शामिल हैं । Bouin के निर्धारण समाधान formaldehyde, picric एसिड और एसिटिक एसिड का एक मिश्रण शामिल है, प्रत्येक घटक एक विशिष्ट और प?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस काम के समर्थन के लिए नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल ऑफ ऑस्ट्रेलिया प्रोजेक्ट ग्रांट APP1103176 को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
DMEM | Thermo | 11960-044 | |
L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
Tris | Astral | 0497-5KG | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
Trypan blue | Sigma | T6146 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
Incubator | Heracell | 150 | |
Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
Coverslip | Thermo | 586 | |
6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |