Analyse av Epididymal proteinsyntese og sekresjon
Summary
Her rapporterer vi immunofluorescence lokalisering av dynamin å illustrere protokollene for påvisning av proteiner i parafin-innebygd mus epididymal inndelinger og de av en udødeliggjort epididymal celle linje (mECap18). Vi beskriver også protokollene for isolering av sekretoriske proteiner fra både epididymal væske og betinget cellen media.
Abstract
Pattedyr bitestikkel genererer en av de mest komplekse intraluminal væskene av alle endokrine kjertel for å støtte den nye testicular modning og lagring av spermatozoa. Slik kompleksitet oppstår på grunn av kombinerte sekretoriske og absorberende aktiviteten til fôr epitelceller. Her beskriver vi teknikker for analyse av epididymal proteinsyntese og sekresjon ved å fokusere på modellen protein familien dynamin (DNM) mechanoenzymes; store GTPases som har potensial til å regulere toveis membran menneskehandel hendelser. For studier av protein uttrykk i epididymal vev beskriver vi robust metode for immunofluorescence merking av målet proteiner i parafin-embedded deler og den etterfølgende oppdagelsen av den romlige fordelingen av disse proteinene via immunofluorescence mikroskopi. Vi beskriver også optimalisert metodikk for isolering og karakterisering av exosome som blemmer, kjent som epididymosomes, som utskilles i den epididymal lumen til å delta i intercellulære kommunikasjon med modne sædceller. Som en komplementær tilnærming beskriver vi også immunofluorescence deteksjon av mål proteiner i en SV40-udødeliggjort musen caput epididymal epitel (mECap18) cellen linje. Videre har diskutere vi verktøyet av mECap18 celle linjen som passer i vitro modell med å utforske regulering av epididymal sekretoriske aktivitet. For dette formålet beskriver vi culturing kravene for vedlikehold av mECap18 celle linjen og bruk av selektiv farmakologiske hemming regimer som kan påvirke deres sekretoriske protein profil. Sistnevnte er vurdert lett via høsting av betinget kultur medium, konsentrasjonen av utskilles proteiner via Trekloredikksyre/aceton nedbør og deres påfølgende analyse via SDS-side og immunoblotting. Vi hevder at disse kombinerte metodene er egnet for analyse av alternativ epididymal protein mål som et forspill til å bestemme sin funksjonelle rolle i sperm modning og/eller lagring.
Introduction
Spermatozoa av alle pattedyrarter erverve potensial til å vise frem progressiv motilitet og befrukte egget under deres langvarig nedstigning bitestikkel, et høyt spesialisert område av mannlige ekstra testicular Ledningskanalsystemet, som kan ta 7-14 dager å navigere (avhengig av arten)1. Ekstreme kondens på farssiden chromatin og blodsutgytelse flertallet av cytoplasma som følger cytodifferentiation spermatozoa i testiklene, er deres påfølgende funksjonelle modning drevet av deres samspill med den epididymal microenvironment. Dette miljøet er, igjen, skapt av sekretoriske og absorberende aktiviteten til fôr epididymal soma og viser en enestående nivå av segmentet-segmentet variant1. Dermed er de mest aktive delene proteinsyntese og sekresjon ligger i den proksimale delen av bitestikkel (nemlig caput og corpus)2. Denne aktiviteten gjenspeiler funksjonelle profilen spermatozoa, med celler første begynnelsen vise kjennetegner funksjonell kompetanse (dvs., progressiv motilitet og muligheten til å binde til syre-solubilized zona glykoproteiner) følgende deres passasje gjennom caput bitestikkel3. Disse funksjonelle attributtene fortsette å utvikle før optimale nivåer som sperm nå den distale epididymal segmentet (cauda), der de er lagret i en passivisert tilstand i beredskap for utløsning. Dannelsen og vedlikeholdet av denne sperm lagring reservoaret er også nært knyttet til fôr epitel, som i cauda domineres av sterke absorberende aktivitet4,5. Selv om anatomiske forskjeller har vært rapportert6,7,8, synes slike regionene arbeidsdeling å være karakteristisk for bitestikkel som deles blant fleste pattedyrarter studerte til dato, inkludert vår egen9,10. Faktisk, fra en klinisk perspektiv, det er kjent at epididymal dysfunksjon er et viktig bidrag til etiologien av mannlig faktor ufruktbarhet11, dermed fremhever viktigheten av å forstå regulering av denne spesialisert vev.
Det er derfor beklagelig at vår forståelse av epididymal fysiologi og mekanismer som regulerer sekvensiell faser av sæd modning og lagring i denne tissue, forblir fullt løses. Blant de medvirkende faktorene er begrensende fremskritt innen epididymal forskning generelle kompleksiteten i dette vevet og kunnskap om mekanismene som utøver regulatoriske kontroll over sine luminal microenvironment. Anatomisk, vet vi at utover æren av caput, corpus og cauda segmenter, bitestikkel kan videre deles inn i flere soner (figur 1A), hver atskilt med septa12 og preget av separate profiler av genet/protein uttrykket13,14,15,16,17,18. Basert på detaljerte transcriptional profilering av Segmentinformasjon genuttrykk i bitestikkel, har faktisk som 6 og 9 forskjellige epididymal soner rapportert i musen og rotte modeller, henholdsvis19,20. Slik kompleksitet antagelig gjenspeiler sammensetningen av den epididymal soma, en pseudostratified epitel består av mange forskjellige celletyper; hver forskjellige forhold til sine overflod, distribusjon og sekretoriske/absorberende aktiviteter langs i tarmkanalen. Dermed er viktigste celler langt den mest tallrike epididymal celle type utgjør opp 80% av alle epitelceller. Følgelig er viktigste celler ansvarlig for mesteparten av epididymal protein biosyntesen og sekresjon5. Derimot er klare celle befolkningen, som rangerer som den nest mest rikelig celle typen innen den epididymal soma, hovedsakelig involvert i selektiv absorpsjon av luminal komponenter og forsuring av denne microenvironment5. Legger til et annet nivå av kompleksitet, utøve androgener og andre lumicrine faktorer av testicular opprinnelse differensial kontroll over hver av disse epididymal celletyper avhengig av deres plassering langs tarmkanalen.
Til tross for begrensningene pålagt av slik kompleksitet, fortsetter betydelig innhugg gjøres i løse mekanistisk grunnlaget for epididymal funksjonen. En nøkkel til disse studiene er anvendelse av avanserte massespektrometri strategier for å etablere bred skala lagerbeholdning på den epididymal proteom, sammen med detaljerte analyser av personlige proteiner valgt blant disse innledende undersøkelser. En illustrasjon av denne tilnærmingen er vår siste karakterisering av DNM mechanoenzymes i mus modell21. Vår første interesse DNM var drevet av sin dual action i koplingen exo – og endocytotic prosesser. Bygge på disse observasjonene, kunne vi vise at de tre kanoniske isoformene av DNM (DNM1 – DNM3) er svært uttrykt i musen bitestikkel og riktig plassert for å oppfylle forskriftsmessige roller i protein sekresjon og absorpsjon21 . Videre kunne vi skille hver DNM isoformen basert på deres mobilnettet og sub mobilnettet lokalisering, dermed antyder at de har utfyllende, i motsetning til redundant aktivitet innen epididymal epitel21.
Her beskriver vi eksperimentell metodikk ansatt for studier av DNM uttrykk i mus bitestikkel med håp om at denne informasjonen vil finne omfattende program i karakterisering av alternativ epididymal proteiner og dermed bidra til vår forståelse av funksjonen av denne viktige delen av mannens reproduksjonsevne skrift. Spesielt beskrive vi utviklingen av robust metode for immunofluorescence merking av målet proteiner i parafin-embedded epididymal deler og den etterfølgende oppdagelsen av den romlige fordelingen av disse proteinene via immunofluorescence mikroskopi. Vi ytterligere dokumentere våre nylig optimalisert protokoller22 for isolering og karakterisering av epididymosomes; små exosome som blemmer som utgjør viktige elementer av epididymal sekretoriske profilen og synes å holde en fremtredende rolle i å fremme sperm modning23. Som en komplementær tilnærming beskriver vi også immunofluorescence deteksjon av mål proteiner i en udødeliggjort musen caput epididymal epitel (mECap18) cellen linje og bruk av denne ressursen som modell med å utforske regulering av epididymal sekretoriske aktivitet i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disse studiene innlemmet bruken av Bouins fast epididymal vev som hadde vært utsatt for parafin innebygging og snitting standardprotokoller. Bouins etappe, den stabiliserende løsningen består av en blanding av formaldehyd, pikrinsyre og eddiksyre, med hver komponent har en bestemt og utfyllende funksjon. Dermed formaldehyd reagerer med primære aminer til protein cross-links, pikrinsyre trenger sakte vevet danner salter og dermed koagulering av grunnleggende proteiner og omvendt, eddiksyre raskt trenger vevet og føre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne National Health and Medical Research Council av Australia prosjektet Grant APP1103176 til støtte for dette arbeidet.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Riferimenti
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf’s thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell’Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
