Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração
Summary
Aqui, descrevemos dois protocolos de isolamento de vesículas extracelulares, centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade, para isolar vesículas extracelulares de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar murino. As vesículas extracelulares derivadas do líquido de lavagem broncoalveolar murino por ambos os métodos são quantificadas e caracterizadas.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) são componentes subcelulares recém-descobertas que desempenham importantes funções no biológico muitas funções de sinalização durante Estados fisiológicos e patológicos. O isolamento de EVs continua a ser um grande desafio neste campo, devido às limitações intrínsecas de cada técnica. A ultracentrifugação diferencial com método de centrifugação gradiente de densidade é uma abordagem comumente usada e é considerada o procedimento padrão ouro para isolamento de EV. No entanto, este procedimento é demorado, trabalhoso e geralmente resulta em baixa capacidade de expansão, que pode não ser adequada para amostras de pequeno volume, como o líquido de lavagem broncoalveolar. Demonstramos que um método de isolamento de centrifugação de ultrafiltração é simples e eficiente tempo – e do trabalho ainda fornece uma recuperação de alto rendimento e pureza. Propomos que este método de isolamento pode ser uma abordagem alternativa que é adequada para o isolamento de EV, particularmente para pequenos volumes de espécimes biológicos.
Introduction
Exosomes são o menor subconjunto de EVs, 50 – 200 nm de diâmetro e tem várias funções biológicas através de um diversificado leque de sinalização processos1,2,3,4,5. Eles governam a homeostase celular e tecido principalmente, facilitando a comunicação intercelular através de moléculas de carga como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos6,7,8,9 . Um passo fundamental na pesquisa de EV é o processo de isolamento. Ultracentrifugação diferencial (UC), com ou sem centrifugação gradiente de densidade (DGC), é considerada a padrão-ouro de abordagem, mas esse método carrega maiores limitações, incluindo taxas de recuperação de EV ineficientes e baixa escalabilidade10 , 11 , 12, que restringem a sua melhor utilização para amostras de volume maiores, tais como célula cultura exossomo sobrenadante ou alta produção. As vantagens e desvantagens dos outros métodos, como exclusão de tamanho por ultrafiltração ou cromatografia, immunoaffinity isolamento por grânulos ou colunas e microfluídica, são bem descritas e modernos procedimentos suplementares têm sido desenvolvidos para superar e minimizar as limitações técnicas em cada abordagem11,12,13,14,15. Outros têm mostrado que uma centrifugação de ultrafiltração (UFC), com uma membrana nanoporous na unidade de filtro é uma técnica alternativa que fornece pureza comparável a uma UC método16,17,18. Esta técnica pode ser considerada como um dos métodos alternativos de isolamento.
Líquido de lavagem broncoalveolar (LBA) contém EVs que possuem inúmeras funções biológicas em várias condições respiratórias de19,20,21,22. Estudando EVs BALF-derivado implica alguns desafios devido a invasão do procedimento de broncoscopia em seres humanos, bem como uma quantidade limitada de recuperação de líquido de lavagem. Em animais de laboratório pequenos tais como ratos, apenas alguns mililitros podem ser recuperados em condições normais de pulmão, muito menos em pulmões inflamados ou fibróticas23. Por conseguinte, coletar uma quantidade suficiente de LBA para isolamento de EV por uma ultracentrifugação diferencial para aplicações a jusante pode não ser viável. No entanto, isolar populações de EV corretas é um fator crucial para o estudo de funções biológicas de EV. O delicado equilíbrio entre eficiência e eficácia continua a ser um desafio bem estabelecidos métodos de isolamento de EV.
Neste estudo atual, podemos demonstrar que uma abordagem de ultrafiltração centrífuga, utilizando uma 100 kDa peso molecular de corte (MWCO) nanomembrane unidade filtrante, é adequada para pequeno volume de amostra biológica como BALF. Esta técnica é simples, eficiente e fornece alta pureza e escalabilidade para apoiar o estudo de EVs BALF-derivado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas últimas décadas, os cientistas têm desvendados os significados de EVs na homeostase celular. Mais importante, EVs jogar papéis importantes em muitos processos de doença, modulando as células vizinhas e distantes a sua carga bioativos moléculas1,21,22,26,27 , 28 , 29 , <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho é suportado por subvenções NHLBI/NIH HL103868 (para PC) e HL137076 (para PC), o americano coração Associação Brasileira (para PC) e o prêmio de pesquisa de câncer de pulmão Samuel Oschin abrangente Cancer Institute (SOCCI) (para PC). Gostaríamos de expressar nosso grande apreço ao Instituto do coração Smidt no Cedars-Sinai Medical Center que fornece-em uma máquina de Nanosight para análise de rastreamento de nanopartículas de EV.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
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