腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造
Summary
ここで腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲル ネイティブ腎臓の細胞外マトリックス (ECM) 構造および生化学的組成を保持するを作製するためのプロトコルを提案する.作製プロセスとその応用を説明します。最後に、このゲルを使用して腎臓固有の細胞およびティッシュの再生とバイオ エンジニア リングをサポートする視点を説明します。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) は、組織の恒常性を維持するために重要な生物物理学的・生化学的手がかりを提供します。現在合成ハイドロゲルは、体外で細胞培養、細胞からの生理学的な行動を引き出すために必要なタンパク質とリガンド組成を欠いている機械の堅牢なサポートを提供しています。この原稿は、適切な機械的な堅牢性と支持の生化学的組成腎臓皮質 ECM から派生したハイドロゲルの作製方法をについて説明します。ヒドロゲルを作製するには、機械的に均質化と脱ひと腎臓皮質 ECM を可します。マトリックスも生理的機械剛性にゲル化を有効にするネイティブ腎臓皮質 ECM タンパク質比を維持します。ヒドロゲルは、生理的条件下で維持できる皮質細胞が腎臓に基板として機能します。さらに、腎臓病の今後の研究を可能にする病的環境をモデル化するゲル組成を操作できます。
Introduction
細胞外マトリックス (ECM) は、組織の恒常性を維持するために重要な生物物理学的・生化学的手がかりを提供します。複雑な分子の構成は、組織の構造と機能の両方のプロパティを調節します。構造タンパク質空間認識を細胞に提供し、の接着や移動の1を可能にします。バインドされた配位子は、2セルの動作を制御する細胞表面の受容体と対話します。腎臓 ECM 分子の組成と構造の解剖学的位置、発達段階と疾患状態3,4によって異なりますの茄多が含まれます。腎臓由来細胞で培養の研究に重要な側面は、ECM の複雑さをさたします。
ECM 微小をレプリケートする以前の試みは、recellularization のできる足場を作成する decellularizing の全体の組織に焦点を当てています。ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) など化学洗剤または非イオン性洗剤で decellularization を実行し、それはどちらか全体の臓器灌流または液浸と撹拌方法5,6,7 を利用して ,8,9,10、11,12,13。ここに示す足場ネイティブ組織 ECM; は、構造および生化学的手がかりを保持します。さらに、ドナー固有のセルと recellularization は、臨床外科14,15,16,17,18, 19です。 ただし、これらの足場の構造の柔軟性を欠いているとの in vitro研究のため多くの現在のデバイスと互換性がありません。この制限を克服するために、多くのグループはさらにゲル20,21,22,23,24に脱 ECM を処理しています。これらのゲルは、射出成形、bioink と互換性のあるおよび細胞足場場所を脱マイクロ メートル スケールの空間的制約を回避します。さらに、分子組成とネイティブの ECM の比は、3、25が保持されます。ここで我々 は腎皮質 ECM (kECM) から派生したゲルを作製する方法を示します。
このプロトコルの目的は、腎臓の皮質領域の微小環境を複製するゲルを生成することです。腎臓皮質組織は、細胞内容物質を削除する定数撹拌下で 1 %sds の溶液で脱です。SDS は、免疫学的細胞材料6,7,9,26をすばやく削除する能力のための組織を decellularize に使用されます。KECM、機械の均質化と凍結乾燥5,6,9,11,26対象になります。ペプシンと強い酸で可溶化は、最終的なハイドロゲル原液20,27の結果します。ネイティブ kECM 蛋白質構造の重要なサポートし、信号の伝達3,25は保持されます。ヒドロゲルは、ネイティブのひと腎臓皮質28,29,30の一桁内にゲルことができます。この行列は、他のマトリックス蛋白質のゲルに比べて腎臓固有の細胞の活動の静穏化を維持するために使用されている生理学的な環境を提供します。さらに、マトリックス組成を通じて操作できます、たとえば、コラーゲン添加-私は、腎線維化およびその他の腎疾患31,32の研究モデル疾患環境に。
Protocol
人間の腎臓は臓器調達機関の協会が定めた倫理的なガイドラインに従う LifeCenter 北西で隔離されました。このプロトコル ワシントン大学で動物のケアと細胞文化のガイドラインに従います。 1. ひと腎臓組織の準備 Decellularization 溶液の調製 5000 mL ビーカー、70 × 10 mm 攪拌棒を滅菌します。 1: 1000 (重量: ボリューム) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ビー?…
Representative Results
KECM ハイドロゲルは、ネイティブ腎臓の微小環境と類似の化学構造を持つ腎臓細胞培養のためのマトリックスを提供します。ヒドロゲルを作製するには、腎臓皮質組織は全体腎臓器官とさいの目に切った (図 1) から機械的に分離されます。洗剤粒子 (図 2 a.4 A.6) を除去する水でリンスが続く化学洗剤 (<strong class=…
Discussion
マトリックスは、細胞の挙動を支配する重要な機械および化学の手がかりを提供します。合成ハイドロゲルは、複雑な 3 次元パターンをサポートしますが、微小生体マトリックスは、多様な細胞の手がかりを提供するために失敗することができます。ネイティブの ECM から派生したゲルは、体内と体外の研究のための理想的な材料です。以前の研究はホスト免疫応答<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、リンと幹細胞と再生医療 LifeCenter 北西の研究所のマイク ガービー イメージング研究室を確認したいと思います。彼らはまたへ北西腎臓の中心から制限されていないギフトと NIH T32 のトレーニングの許可 DK0007467 (R.J.N.) に DP2DK102258 (Y.Z.) に UH2/UH3 TR000504 (公団) に国立衛生研究所の助成金の助成を受けたい、腎臓研究所
Materials
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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Citazione di questo articolo
Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).