Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Summary

Nous présentons ici un protocole pour fabriquer un rein cortex extracellulaire dérivé de matrice hydrogel pour conserver la composition biochimiques et structurales du rein natif de la matrice extracellulaire (MEC). Le processus de fabrication et ses applications sont décrites. Enfin, un point de vue sur l’utilisation de cet hydrogel pour soutenir la bioingénierie et la régénération cellulaire et tissulaire rénale spécifique est discutée.

Abstract

Matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices biochimiques et biophysiques importants pour maintenir l’homéostasie tissulaire. Hydrogels synthétiques actuels offrent soutien mécanique robuste pour in vitro culture cellulaire, mais n’ont pas la composition protéique et ligand nécessaire pour provoquer un comportement physiologique des cellules. Ce manuscrit décrit une méthode de fabrication pour un rein cortex dérivés ECM hydrogel avec bonne robustesse mécanique et la composition biochimique favorable. L’hydrogel est fabriquée par mécaniquement l’homogénéisation et cortex DECELLULARISE rein humain ECM de solubilisation. La matrice conserve les rapports de protéine native rein cortex ECM tout en permettant aussi de gélification à des rigidités mécaniques physiologiques. L’hydrogel sert de substrat sur lequel rein cortex dérivées des cellules peuvent être maintenus dans des conditions physiologiques. En outre, la composition de l’hydrogel peut être manipulée pour modéliser un environnement malade qui permet l’étude future des maladies rénales.

Introduction

Matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices biochimiques et biophysiques importants pour maintenir l’homéostasie tissulaire. La composition moléculaire complexe régit les propriétés structurales et fonctionnelles du tissu. Protéines structurales confèrent des cellules la conscience spatiale et permettent pour l’adhérence et la migration¹. Ligands liés interagissent avec les récepteurs de surface cellulaire pour contrôler le comportement de cellule². Rein ECM contient une multitude de molécules dont la composition et structure varie selon la localisation anatomique, stade de développement et maladie état^3,4. Récapitulant la complexité de l’ECM est un élément clé dans l’étude des cellules rénales in vitro.

Les tentatives précédentes à reproduire des micro-environnements ECM ont porté sur decellularizing tissus ensemble pour créer des échafaudages capables de recellularization. DÉCELLULARISATION a été exécutée avec des détergents chimiques comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou détergents non ioniques, et il utilise soit organe entier perfusion ou immersion et agitation méthodes^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13}. Les échafaudages présentées ici préserver les indices biochimiques et structurales, trouvés dans les tissus natifs ECM ; en outre, recellularization avec les cellules de donneur spécifique a pertinence clinique en chirurgie reconstructive^{14,15,16,17,18, 19}. Toutefois, ces échafaudages manquent de flexibilité structurelle et sont donc incompatibles avec de nombreux appareils actuelles utilisés pour des études in vitro . Pour contourner cette limitation, de nombreux groupes ont transformés DECELLULARISE ECM en hydrogels^{20,21,22,23,24}. Ces hydrogels sont compatibles avec bioink et moulage par injection et contourner les contraintes spatiales d’échelle micromètre qui DECELLULARISE lieu d’échafaudages sur les cellules. En outre, composition moléculaire et ratios trouvés dans les natif CME sont conservés^3,25. Nous démontrons une méthode pour fabriquer un hydrogel dérivé du cortex rénal ECM (kECM).

Ce protocole vise à produire un hydrogel qui réplique le microenvironnement de la région corticale du rein. Tissu de cortex rénal est DECELLULARISE dans une solution à 1 % SDS sous agitation constante pour enlever les matières cellulaires. SDS est couramment utilisé pour decellularize les tissus en raison de sa capacité à supprimer rapidement immunologique cellulaire matériau^6,7,9,26. Le kECM est ensuite soumis à l’homogénéisation mécanique et lyophilisation^5,6,9,11,26. Solubilisation dans un acide fort avec la pepsine se traduit par un hydrogel final solution mère^20,27. Protéines kECM indigènes qui sont importants pour la structure support et signalent transduction sont conservés^3,25. L’hydrogel peut également être gélifié à un ordre de grandeur du rein humain natif cortex^28,29,30. Cette matrice fournit un environnement physiologique qui a été utilisé pour maintenir la quiescence des cellules de rein spécifiques par rapport aux hydrogels d’autres protéines de la matrice. En outre, composition de la matrice peut être manipulée, par exemple, grâce à l’ajout de collagène-je, aux milieux de maladie de modèle pour l’étude de la fibrose rénale et autres reins maladies^31,32.

Protocol

Reins humains ont été isolées du Nord-Ouest LifeCenter, suivant les directives éthiques fixés par l’Association des organisations de marchés orgue. Ce protocole suit animaux soins et cellule culture lignes directrices établies par l’Université de Washington. 1. préparation du tissu rénal humain Préparation de la solution de DÉCELLULARISATION Stériliser un bécher de 5000 mL et d’un bar de remuer de 70 x 10 mm. Mélanger 1/1000 (poids : volume) d…

Representative Results

L’hydrogel kECM fournit une matrice pour culture de cellules de rein avec une composition chimique similaire comme le microenvironnement rein natif. Pour fabriquer l’hydrogel, tissu de cortex rénal est mécaniquement isolé d’un organe rein entier et coupé en dés (Figure 1). DÉCELLULARISATION avec un détergent chimique (Figure 2 a.1-A.3) suivie de rinçages à l’eau pour enlever les particules de dé…

Discussion

Matrices fournissent des signaux mécaniques et chimiques importantes qui régissent le comportement de la cellule. Hydrogels synthétiques sont capables de soutenir la structuration 3-dimensional complexe mais ne parviennent pas à fournir les divers signaux extracellulaires dans des micro-environnements matrice physiologique. Hydrogels dérivés ECM natif sont des matériaux idéaux pour les études aussi bien in vivo et in vitro . Des études antérieures ont utilisé DECELLULARISE ECM hydrogels pour…

Materials

Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	436143
Sterile H2O			Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)	Fisher Science	14-512-128
500 mL Vacuum Filter	VWR	97066-202
Stir Plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420D
1000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	CLS10031L
Forceps	Sigma-Aldrich	F4642	Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp	Sigma-Aldrich	Z168866
Dissecting Scissors	Sigma-Aldrich	Z265977
Scalpel Handle, No. 4	VWR	25859-000	Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20	VWR	25860-020	Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)	Fisher Science	14-513-52
Absorbent Underpad	VWR	82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm)	Corning	430597
Autoclavable Biohazard Bag	VWR	14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um)	Fisher Science	22-363-547
Cell Culture Grade Water	HyClone	SH30529.03
30 mL Freestanding Tube	VWR	89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine	Polytron	PCU-20110
Freeze Dryer	Labconco	7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap	Sigma-Aldrich	V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)	Fisher Science	14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P7012
0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile)	Sigma-Aldrich	415413	Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199	Sigma-Aldrich	M4530
15 mL Conical Tube	ThermoFisher	339651
Cell Culture Media	ThermoFisher	11330.032	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X	Life Technologies	15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X	Life Technologies	51300-044
1 mL Syringe	Sigma-Aldrich	Z192325
Microspatula	Sigma-Aldrich	Z193208