Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel
Summary
Qui presentiamo un protocollo per fabbricare un rene corteccia extracellulare derivata matrice idrogel per mantenere la composizione strutturale e biochimica del rene nativo di matrice extracellulare (ECM). Il processo di fabbricazione e le sue applicazioni sono descritte. Infine, una prospettiva sull’utilizzo questo idrogel per supportare la bioingegneria e la rigenerazione cellulare e tessutale del rene-specifici è discussa.
Abstract
Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l’omeostasi del tessuto. Corrente idrogel sintetico offrono robusto supporto meccanico per in vitro colture cellulari ma manca la composizione proteica e ligando necessaria per suscitare fisiologico comportamento dalle cellule. Questo manoscritto descrive un metodo di fabbricazione per un rene corteccia ECM-derivato idrogel con adeguata robustezza meccanica e solidale composizione biochimica. L’idrogel è realizzato meccanicamente omogeneizzazione e solubilizzanti corteccia del rene umano decellularizzati ECM. La matrice mantiene rapporti di proteina di Natale del rene corteccia ECM consentendo anche gelificazione a rigidità meccanica fisiologica. L’idrogel funge da un substrato su cui rene cellule derivate da corteccia possono essere mantenute in condizioni fisiologiche. Inoltre, la composizione di idrogel possa essere manipolata per modellare un ambiente malato che consente lo studio futuro di malattie renali.
Introduction
Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l’omeostasi del tessuto. La composizione molecolare complessa disciplina proprietà strutturali e funzionali del tessuto. Proteine strutturali forniscono cellule con consapevolezza spaziale e permettono di adesione e migrazione1. Associato ligandi interagiscono con recettori di superficie per controllare il comportamento di cella2. Rene ECM contiene una miriade di molecole la cui composizione e la struttura varia a seconda della posizione anatomica, fase inerente allo sviluppo e malattia stato3,4. Ricapitolando la complessità di ECM è un aspetto fondamentale nello Studio in vitrodi cellule derivate dal rene.
I precedenti tentativi di replicare microambienti ECM si sono concentrati sul tessuto decellularizing tutto per creare impalcature in grado di ricellularizzazione. Decellularizzazione è stata eseguita con detergenti chimici come sodio dodecil solfato (SDS) o detergenti non ionici, e utilizza sia organo intero aspersione o immersione e agitazione metodi5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. I ponteggi presentati qui preservare gli spunti strutturali e biochimici trovati in tessuto nativo ECM; Inoltre, ricellularizzazione con cellule del donatore-specific ha rilevanza clinica in chirurgia ricostruttiva14,15,16,17,18, 19. Tuttavia, queste impalcature mancano di flessibilità strutturale e pertanto non sono compatibili con molti dispositivi a corrente utilizzati per gli studi in vitro . Per ovviare a questa limitazione, molti gruppi hanno ulteriormente elaborato decellularizzati ECM in idrogel20,21,22,23,24. Questi idrogeli sono compatibili con bioink e stampaggio ad iniezione ed eludere micrometro scala spaziale i vincoli che decellularized ponteggi posto sulle cellule. Inoltre, composizione molecolare e rapporti trovati in nativo ECM vengono mantenuti3,25. Qui dimostriamo un metodo per fabbricare un idrogel derivato dalla corteccia del rene ECM (kECM).
Lo scopo del presente protocollo è quello di produrre un idrogel che replica il microambiente della regione corticale del rene. Tessuto del rene corteccia è decellularized in una soluzione di SDS 1% sotto costante agitazione per rimuovere la materia cellulare. SDS è comunemente usato per decellularize del tessuto a causa della sua capacità di rimuovere rapidamente immunologici cellulari materiale6,7,9,26. Il kECM è quindi soggetto a omogeneizzazione meccanica e liofilizzazione5,6,9,11,26. Solubilizzazione in un acido forte con pepsina si traduce in un finale idrogel soluzione stock20,27. KECM nativo di proteine che sono importanti per strutturale supportano e segnale di trasduzione sono conservate3,25. L’idrogel può anche essere gelificato all’interno di un ordine di grandezza di Natale del rene umano corteccia28,29,30. Questa matrice fornisce un ambiente fisiologico che è stato utilizzato per mantenere la quiescenza delle cellule del rene-specifici rispetto a idrogeli da altre proteine della matrice. Inoltre, composizione di matrice possa essere manipolati, ad esempio, attraverso l’aggiunta di collagene-I, per ambienti di malattia di modello per lo studio della fibrosi renale ed altri malattie di rene31,32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrici di forniscono importanti indicazioni meccaniche e chimiche che governano il comportamento delle cellule. Idrogeli sintetici sono in grado di supportare complesse patterning 3-dimensionale, ma non riescono a fornire i diversi segnali extracellulari trovati in microambienti matrice fisiologica. Idrogel derivato dal nativo ECM sono materiali ideali per studi sia in vivo che in vitro . Precedenti studi hanno utilizzato decellularizzati ECM idrogeli per rivestire biomateriali sintetici per evitare<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori si desidera ringraziare la Lynn e Mike Garvey Imaging laboratorio presso l’Istituto per le cellule staminali e medicina rigenerativa e LifeCenter NorthWest. Vorrebbero anche riconoscere il sostegno finanziario di sovvenzioni National Institutes of Health, UH2/UH3 TR000504 (di J.H.) e DP2DK102258 (per Y.Z.), NIH T32 formazione grant DK0007467 (per R.J.N.) e un regalo senza restrizione dai centri nord-ovest del rene per la Istituto di ricerca del rene.
Materials
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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