날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔
Summary
여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.
Abstract
세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 현재 합성 hydrogels 체 외에서 세포 배양 하지만 부족 필요한 단백질과 리간드 컴포지션 셀에서 생리 적 행동을 이끌어내는 강력한 기계적인 지원을 제공 합니다. 이 원고는 적절 한 기계적 견고성 및 지원 생 화 확 적인 구성으로 신장 피 질 ECM 파생 된 하이드로 겔의 제조 방법을 설명합니다. 히드로 기계적 조직 및 decellularized 인간 신장 피 질 ECM solubilizing 조작 이다. 매트릭스도 생리 적인 기계 stiffnesses 겔 화 하면서 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율을 유지 합니다. 히드로 신장에 따라 피 질에서 파생 된 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 또한, 하이드로 겔 조성 장병의 미래 연구를 가능 하 게 병 환경을 모델링을 조작할 수 있습니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 복잡 한 분자 구성 조직의 구조 및 기능 속성을 조정합니다. 구조 단백질 셀 공간 인식 수 있으며 접착 및 마이그레이션1있습니다. 바운드 ligands 제어 셀 동작2세포 표면 수용 체 상호 작용. 신장 ECM 분자의 조성과 구조에 따라 해부학 적 위치, 발달 단계, 및 질병 상태3,4의 과다를 한 포함 되어 있습니다. ECM의 복잡성을 업과 신장 파생 셀 체 외공부에서 핵심 요소 이다.
ECM microenvironments 복제에 이전 시도 recellularization의 건설 기계를 만드는 decellularizing 전체 조직에 집중 했다. Decellularization 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 등 화학 세제 또는 비 이온 세제, 수행 하 고 중 전체 장기 관류 또는 침수와 교 반 방법5,6,7 활용 ,,89,10,11,,1213. 여기에 제시 된 건설 기계 구조 및 생 화 확 적인 신호 기본 조직 ECM;에 보존 또한, 기증자-특정 셀과 recellularization에 임상 관련성 재건 수술14,15,,1617,18, 그러나 19., 이러한 건설 기계 구조 유연성 부족 하 고 따라서 생체 외에서 연구를 위해 사용 하는 많은 현재 장치와 호환 되지 않습니다. 이 한계를 극복, 많은 그룹이 추가 처리 decellularized ECM hydrogels20,,2122,,2324에. 이러한 hydrogels 사출 성형 및 bioink와 호환 되며 decellularized 세포에 건설 기계 장소 마이크로미터 스케일 공간 제약을 우회. 또한, 분자 구성 및 네이티브 ECM에서 발견 비율3,25유지 됩니다. 여기 신장 피 질 ECM (kECM)에서 파생 된 하이드로 겔을 조작 하는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 목적은 신장 피 질 영역의 microenvironment 복제 하는 하이드로 겔을 생산 하는 것입니다. 신장 피 질 조직 세포 문제를 제거 하려면 지속적인 동요에서 1 %SDS 솔루션에서 decellularized입니다. SDS 면역 세포 소재6,7,,926를 신속 하 게 제거 하는 기능 조직 decellularize에 일반적으로 사용 됩니다. kECM는 다음 기계적 균질 및 동결은5,,69,,1126. 펩 신으로 강한 산에 가용 화 최종 히드로 재고 솔루션20,27에 발생합니다. 기본 kECM 단백질 구조에 대 한 중요 한 지원 및 신호 변환3,25유지 됩니다. 또한 네이티브 인간의 신장 피 질28,,2930의 한 차수 내는 히드로에 gelled 수 있습니다. 이 매트릭스는 다른 매트릭스 단백질에서 hydrogels에 비해 신장 특정 셀의 정지를 유지 하기 위해 사용 된 생리 적 환경의 제공 합니다. 또한, 매트릭스 구성을 조작할 수 있습니다, 예를 들어 콜라겐의 추가 통해-나, 신장 섬유 증 및 다른 신장 질환31,32의 연구에 대 한 모델 질병 환경.
Protocol
인간의 신장 LifeCenter 북 서 윤리 지침을 장기 조달 단체의 협회에 의해 설정에 의해 고립 되었다. 이 프로토콜은 워싱턴 대학에 의해 제시 된 동물 관심과 셀 문화 지침을 따릅니다. 1입니다. 인간 신장 조직 준비 Decellularization 솔루션의 준비 소독 5000 mL 비 커와 70 x 10 m m 저 어 바. 1:1000 (무게: 볼륨) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 비 커에 압력가 이온된 수에 ?…
Representative Results
KECM 히드로 네이티브 신장 microenvironment로 유사한 화학 성분과 신장 세포 배양에 대 한 매트릭스를 제공합니다. 조작 된 하이드로 겔, 하 신장 피 질 조직 전체 신장 기관 및 절단된 (그림 1)에서 기계적으로 격리 됩니다. 화학 세제 (그림 2A.1 A.3) 세제 입자 (그림 2A.4 A.6)를 제거 하는 …
Discussion
행렬 셀 동작을 제어 하는 중요 한 기계 및 화학 신호를 제공 합니다. 합성 hydrogels 복잡 한 3 차원 패턴을 지원 하지만 생리 매트릭스 microenvironments에서 다양 한 세포 외 신호를 제공 하지 못하는 수 있습니다. Hydrogels 네이티브 ECM에서 파생 된는 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구를 위한 이상적인 물자 이다. 이전 연구를 사용 하 고 decellularized ECM hydrogels 호스트 면역학 응답<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 린 마이크가 비 이미징 연구실 줄기 세포 및 재생 의학 및 LifeCenter 북 서 연구소에서 인정 하 고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국가 학회 교부 금, UH2/UH3 TR000504 (재 혁)에 (Y.Z.)에 DP2DK102258, NIH T32 훈련 부여 DK0007467 (R.J.N.), 북 서 신장 센터를에서 제한 없는 선물의 금융 지원을 인정 하 고 싶습니다는 신장 연구소입니다.
Materials
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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Citazione di questo articolo
Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).