Fabrikere en nyre Cortex ekstracellulær Matrix-avledet Hydrogel

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å dikte en nyre cortex ekstracellulær matrix-avledet hydrogel for å beholde opprinnelige nyre ekstracellulær matrix (EFM) strukturelle og biokjemiske sammensetningen. Fabrikasjon prosessen og tilhørende programmer er beskrevet. Til slutt, et perspektiv på bruker denne hydrogel støtte nyre-spesifikke cellular og vev gjenfødelse og bioteknologi er diskutert.

Abstract

Ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig Biofysiske og biokjemiske signaler for å opprettholde vev homeostase. Gjeldende syntetisk hydrogels tilbyr robust mekanisk støtte for i vitro celle kultur, men mangler nødvendig protein og ligand sammensetningen for å vekke fysiologiske oppførsel fra celler. Dette manuskriptet beskriver en fabrikasjon metode for en nyre cortex ECM-avledet hydrogel med riktig mekanisk robusthet og støttende biokjemisk komposisjon. Hydrogel er fabrikkert av mekanisk homogenisere og solubilizing decellularized menneskelige nyre cortex ECM. Matrix bevarer opprinnelig nyre cortex ECM protein prosenter mens også gelation til fysiologiske mekaniske stiffnesses. Hydrogel fungerer som et substrat på hvilke nyre cortex-avledet celler kan opprettholdes under fysiologiske forhold. Videre kan hydrogel sammensetningen manipuleres for å modellere et sykt miljø som gjør at fremtidige studiet av nyre sykdommer.

Introduction

Ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig Biofysiske og biokjemiske signaler for å opprettholde vev homeostase. Komplekse molekylær sammensetningen regulerer både strukturelle og funksjonelle egenskaper av vev. Strukturelle proteiner gi celler med romlig bevissthet og muliggjøre vedheft og migrasjon¹. Bundet ligander samhandle med celleoverflaten reseptorer å kontrollere celle oppførsel². Nyre ECM inneholder en mengde molekyler som komposisjon og struktur varierer avhengig av anatomiske plasseringen, utviklingsstadiet og sykdom staten^3,4. Recapitulating kompleksiteten av ECM er en sentral del i å studere nyre-avledet celler i vitro.

Tidligere forsøk på å replikere ECM microenvironments har fokusert på decellularizing hele vev lage stillaser i stand til å recellularization. Decellularization er utført med kjemiske rengjøringsmidler som natrium dodecyl sulfate (SDS) eller ikke-ioniske vaskemidler, og det utnytter enten hele organ perfusjon eller nedsenking og agitasjon metoder^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13}. Stillasene presenteres her bevare strukturelle og biokjemiske signaler i eget vev ECM; Videre recellularization med donor-spesifikke celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi^{14,15,16,17,18, 19}. imidlertid disse stillaser mangler strukturelle fleksibilitet og er derfor ikke kompatible med mange gjeldende enheter for i vitro studier. For å overkomme denne begrensningen, har mange grupper ytterligere behandlet decellularized ECM i hydrogels,^20,,^21,,^22,,^23,,²⁴. Disse hydrogels er kompatible med injeksjon molding og bioink og omgå mikrometer skala romlige begrensninger som decellularized stillaser sted på celler. Videre beholdes molekylær sammensetning og prosenter i native ECM^3,25. Her viser vi en metode for å dikte et hydrogel avledet fra nyre cortex ECM (kECM).

Formålet med denne protokollen er å produsere en hydrogel som reproduserer microenvironment av nyre kortikale området. Nyre cortex vev er decellularized i en 1% SDS løsning under konstant agitasjon fjerne cellulære saken. SDS brukes vanligvis til decellularize vev på grunn av sin evne til å raskt fjerne immunologiske mobilnettet materiale^6,7,9,26. KECM er da mekanisk homogenisering og lyophilization,^5,,^6,,^9,,^11,,²⁶. Solubilization i en sterk syre med pepsin resulterer i en siste hydrogel lagerløsning^20,27. Native kECM proteiner som er viktig for strukturell støtte og signalisere signaltransduksjon beholdes^3,25. Hydrogel kan også være gelled til innenfor en størrelsesorden innfødt menneskelige nyre cortex^28,29,30. Denne matrisen gir en fysiologisk miljø som er brukt til å opprettholde gågaten i nyre-spesifikke celler i forhold til hydrogels fra andre matrix proteiner. Videre matrix komposisjon kan manipuleres, for eksempel gjennom tillegg av kollagen-jeg, til modellen sykdom miljøer for studiet av nyre fibrose og andre nyre sykdommer^31,32.

Protocol

Menneskets nyrer ble isolert av LifeCenter nordvest etter etiske retningslinjer satt av foreningen for orgel innkjøp organisasjoner. Denne protokollen følger dyr omsorg og celle kultur retningslinjene skissert av University of Washington. 1. forberedelse av menneskelig nyre vev Utarbeidelse av decellularization løsning Sterilisere en 5000 mL kanne og 70 x 10 mm rør bar. Bland 1:1000 (vekt: volum) natrium dodecyl sulfate (SDS) i autoklaveres deionisert vann bege…

Representative Results

KECM-hydrogel gir en matrise for nyre cellekultur liknende kjemisk sammensetning som den opprinnelige nyre microenvironment. For å utvikle hydrogel, er nyre cortex vev mekanisk isolert fra en hel nyre orgel og terninger (figur 1). Decellularization med kjemiske vaskemiddel (figur 2A.1-A.3) etterfulgt av skyller med vann for å fjerne vaskemiddel partikler (figur 2A.4-A.6</st…

Discussion

Matriser gir viktig mekaniske og kjemiske signaler som regulerer celle atferd. Syntetisk hydrogels er i stand til å støtte komplekse 3-dimensjonale mønster men ikke klarer å gi ulike ekstracellulære signaler i fysiologiske matrise microenvironments. Hydrogels fra innfødte ECM er ideelle materialer for både i vivo og vitro studier. Tidligere studier har brukt decellularized ECM hydrogels til coat syntetiske biologisk materiale for å hindre vert immunologiske svar^33,</…

Materials

Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	436143
Sterile H2O			Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)	Fisher Science	14-512-128
500 mL Vacuum Filter	VWR	97066-202
Stir Plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420D
1000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	CLS10031L
Forceps	Sigma-Aldrich	F4642	Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp	Sigma-Aldrich	Z168866
Dissecting Scissors	Sigma-Aldrich	Z265977
Scalpel Handle, No. 4	VWR	25859-000	Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20	VWR	25860-020	Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)	Fisher Science	14-513-52
Absorbent Underpad	VWR	82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm)	Corning	430597
Autoclavable Biohazard Bag	VWR	14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um)	Fisher Science	22-363-547
Cell Culture Grade Water	HyClone	SH30529.03
30 mL Freestanding Tube	VWR	89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine	Polytron	PCU-20110
Freeze Dryer	Labconco	7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap	Sigma-Aldrich	V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)	Fisher Science	14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P7012
0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile)	Sigma-Aldrich	415413	Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199	Sigma-Aldrich	M4530
15 mL Conical Tube	ThermoFisher	339651
Cell Culture Media	ThermoFisher	11330.032	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X	Life Technologies	15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X	Life Technologies	51300-044
1 mL Syringe	Sigma-Aldrich	Z192325
Microspatula	Sigma-Aldrich	Z193208