Qui presentiamo un protocollo per fabbricare un rene corteccia extracellulare derivata matrice idrogel per mantenere la composizione strutturale e biochimica del rene nativo di matrice extracellulare (ECM). Il processo di fabbricazione e le sue applicazioni sono descritte. Infine, una prospettiva sull'utilizzo questo idrogel per supportare la bioingegneria e la rigenerazione cellulare e tessutale del rene-specifici è discussa.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l'omeostasi del tessuto. Corrente idrogel sintetico offrono robusto supporto meccanico per in vitro colture cellulari ma manca la composizione proteica e ligando necessaria per suscitare fisiologico comportamento dalle cellule. Questo manoscritto descrive un metodo di fabbricazione per un rene corteccia ECM-derivato idrogel con adeguata robustezza meccanica e solidale composizione biochimica. L'idrogel è realizzato meccanicamente omogeneizzazione e solubilizzanti corteccia del rene umano decellularizzati ECM. La matrice mantiene rapporti di proteina di Natale del rene corteccia ECM consentendo anche gelificazione a rigidità meccanica fisiologica. L'idrogel funge da un substrato su cui rene cellule derivate da corteccia possono essere mantenute in condizioni fisiologiche. Inoltre, la composizione di idrogel possa essere manipolata per modellare un ambiente malato che consente lo studio futuro di malattie renali.
Introduzione
Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l'omeostasi del tessuto. La composizione molecolare complessa disciplina proprietà strutturali e funzionali del tessuto. Proteine strutturali forniscono cellule con consapevolezza spaziale e permettono di adesione e migrazione1. Associato ligandi interagiscono con recettori di superficie per controllare il comportamento di cella2. Rene ECM contiene una miriade di molecole la cui composizione e la struttura varia a seconda della posizione anatomica, fase inerente allo sviluppo e malattia stato3,....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Reni umani sono stati isolati da LifeCenter Northwest seguendo linee guida etiche impostate per l'associazione delle organizzazioni di approvvigionamento dell'organo. Questo protocollo segue animale linee guida cultura cura e cella delineate dalla Università di Washington.
1. preparazione del tessuto del rene umano
- Preparazione della soluzione di decellularizzazione
- Sterilizzare un becher da mL 5000 e un ancoretta 70 x 10 mm.
- Mescolare 1: 1000 (peso: volume) sodio dodecil solfato (SDS) in acqua deionizzata in autoclave nel becher. Lasciare la soluzione su un piatto di mescolare a circa 200 rpm per 24 ore o fino ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'idrogel di kECM fornisce una matrice per la coltura delle cellule del rene con composizione chimica simile come il microambiente di Natale del rene. Per fabbricare l'idrogel, tessuto del rene corteccia è meccanicamente isolato da un organo rene intero e tagliato a dadini (Figura 1). Decellularizzati con un detersivo chimico (Figura 2A.1-a. 3) seguito da risciacqui con acqua per rimuovere le particelle di deters.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Matrici di forniscono importanti indicazioni meccaniche e chimiche che governano il comportamento delle cellule. Idrogeli sintetici sono in grado di supportare complesse patterning 3-dimensionale, ma non riescono a fornire i diversi segnali extracellulari trovati in microambienti matrice fisiologica. Idrogel derivato dal nativo ECM sono materiali ideali per studi sia in vivo che in vitro . Precedenti studi hanno utilizzato decellularizzati ECM idrogeli per rivestire biomateriali sintetici per evitare
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori si desidera ringraziare la Lynn e Mike Garvey Imaging laboratorio presso l'Istituto per le cellule staminali e medicina rigenerativa e LifeCenter NorthWest. Vorrebbero anche riconoscere il sostegno finanziario di sovvenzioni National Institutes of Health, UH2/UH3 TR000504 (di J.H.) e DP2DK102258 (per Y.Z.), NIH T32 formazione grant DK0007467 (per R.J.N.) e un regalo senza restrizione dai centri nord-ovest del rene per la Istituto di ricerca del rene.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Preparazione del tessuto renale | |||
| 5000 mL Becher | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| sterile H2O | Autoclavato DI H2O | ||
| Barra di agitazione (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| Filtro per vuoto da 500 mL | VWR | 97066-202 | |
| Piastra di agitazione | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| Bicchiere da 1000 mL | Pinza Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Sigma-Aldrich | F4642 | È possibile utilizzare qualsiasi pinza simile | |
| Morsetto emostatico con impugnatura a forbice | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Forbici da dissezione | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Manico per bisturi, n. 4 | VWR | 25859-000 | È possibile utilizzare qualsiasi manico di bisturi simile |
| Lama per bisturi, n. 20 | VWR | 25860-020 | È possibile utilizzare qualsiasi lama per bisturi simile |
| Barra di agitazione (38,1 x 9,5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Imbottitura assorbente | VWR | 82020-845 | |
| Piastra di Petri (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Sacca autoclavabile per rischi biologici | VWR | 14220-026 | |
| Filtro cellulare sterile (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Acqua per colture cellulari | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Provetta autoportante | VWR | 89012-778 | |
| Fabbricazione di ECM Gel | |||
| Tissue Omogeneizzatore | Polytron | PCU-20110 | |
| Liofilizzatore | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Fiale di scintillazione in vetro e tappo | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15,9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsina da mucosa gastrica suina | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0,01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Diluire a 0,01 N HCl con acqua per coltura cellulare |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Diluire a 1 N in acqua per colture cellulari |
| Terreno 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Provetta conica | ThermoFisher | 339651 | |
| Terreni di coltura cellulare | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12) |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotico-Antimicotico 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Soluzione di insulina, transferrina, selenio, piruvato di sodio ( ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| Siringa da 1 ml | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatola | Sigma-Aldrich | Z193208 |
Riferimenti
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
