Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para fabricar um rim córtex extracelulares matriz-derivado hidrogel para manter a composição de estruturais e bioquímicos de matriz extracelular (ECM) do rim nativo. O processo de fabricação e suas aplicações são descritas. Finalmente, uma perspectiva sobre como usar este hidrogel para apoiar a bioengenharia e a regeneração celular e tecido de rim-específicas é discutida.
Abstract
Matriz extracelular (ECM) fornece importantes pistas biofísicas e bioquímicas para manter a homeostase do tecido. Hidrogel sintético atual oferece suporte mecânico robusto em vitro cultura de células, mas falta a composição de proteínas e ligante necessária para eliciar comportamentos fisiológicos das células. Este manuscrito descreve um método de fabricação para um hidrogel de ECM-derivado de córtex renal com robustez mecânica adequada e apoia composição bioquímica. O hidrogel é fabricada por mecanicamente, homogeneizando e solubilizing córtex renal humana decellularized ECM. A matriz preserva rácios de proteína nativa renal córtex ECM, permitindo também a criação de gelificação para stiffnesses mecânicas fisiológicas. O hidrogel serve como substrato ao qual nos rins córtex-derivado de células podem ser mantidas sob condições fisiológicas. Além disso, a composição de hidrogel pode ser manipulada para modelar um ambiente de doente que permite o estudo futuro das doenças renais.
Introduction
Matriz extracelular (ECM) fornece importantes pistas biofísicas e bioquímicas para manter a homeostase do tecido. A composição molecular complexa regula propriedades estruturais e funcionais do tecido. Proteínas estruturais fornecem células com consciência espacial e permitam a migração e adesão1. Ligantes acoplados interagem com receptores de superfície celular para controlar o comportamento de célula2. Rim ECM contém uma infinidade de moléculas cuja composição e estrutura varia dependendo da localização anatômica, grau de desenvolvimento e doença estado3,4. Recapitulando a complexidade do ECM é um aspecto fundamental no estudo de células de rim-derivado em vitro.
Tentativas anteriores de replicar o microambiente ECM focaram-se decellularizing todo tecido para criar andaimes capaz de recellularization. Decellularization tem sido realizado com detergentes químicos tais como sulfato dodecyl de sódio (SDS) ou detergentes não-iônicos, e utiliza qualquer órgão inteiro perfusão ou imersão e agitação métodos5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Os andaimes aqui apresentados preservar as pistas estruturais e bioquímicas encontradas no tecido nativo ECM; Além disso, recellularization com células específicas do doador tem relevância clínica em cirurgia reconstrutiva14,15,16,17,18, 19. no entanto, estes andaimes falta flexibilidade estrutural e, portanto, são incompatíveis com muitos dispositivos atuais usados para estudos em vitro . Para contornar essa limitação, muitos grupos têm ulteriormente decellularized ECM em hidrogel20,21,22,23,24. Estes hidrogel é compatíveis com bioink e moldagem por injeção e contornar micrômetro escala espacial restrições que decellularized lugar de andaimes nas células. Além disso, a composição molecular e rácios encontrados em ECM nativo são preservados3,25. Aqui vamos demonstrar um método para fabricar um hidrogel derivado de córtex renal ECM (kECM).
O propósito do presente protocolo é produzir um hidrogel que Replica o microambiente da região cortical do rim. Tecido de córtex renal é decellularized em uma solução de SDS 1% sob agitação constante para remover a matéria celular. SDS é comumente usado para decellularize de tecido devido à sua capacidade de remover rapidamente o material celular imunológica6,7,9,26. O kECM é então sujeito a homogeneização mecânica e liofilização5,6,9,11,26. Solubilização de um ácido forte com pepsina resulta em uma solução de hidrogel final20,27. KECM nativo de proteínas que são importantes para estrutural suportam e sinal de transdução estão preservados3,25. O hidrogel pode também ser gelificada para dentro de uma ordem de magnitude de rim humano nativo córtex28,29,30. Esta matriz fornece um ambiente fisiológico que tem sido usado para manter a quiescência de células específicas do rim em comparação com hidrogel de outras proteínas da matriz. Além disso, composição da matriz pode ser manipulada, por exemplo, através da adição de colágeno-I, ambientes de doença de modelo para o estudo de fibrose renal e outras doenças de rim31,32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrizes fornecem importantes dicas mecânicas e químicas que regem o comportamento da célula. Hidrogel sintético é capazes de apoiar a padronização 3-dimensional complexa mas não apresentar as diversas pistas extracelulares encontradas no microambiente matriz fisiológica. Hidrogel derivado de ECM nativo é materiais ideais para estudos tanto in vivo e in vitro . Estudos anteriores usaram decellularized ECM hidrogel para revestir biomateriais sintéticos para evitar33<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer a Lynn e Mike Garvey Imaging laboratório do Instituto de células-tronco e medicina regenerativa e LifeCenter noroeste. Eles também gostaria de agradecer o apoio financeiro da National Institutes of Health subvenções, UH2/UH3 TR000504 (de J.H.) e DP2DK102258 (para Y.Z.), NIH T32 formação grant DK0007467 (R.J.N.) e um presente sem restrições os centros de rim do noroeste para o Instituto de pesquisa do rim.
Materials
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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