JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Изготовления внеклеточная матрица производные гидрогеля почек коры

Published: October 13, 2018
doi:
10.3791/58314
, , ,
1Department of Bioengineering,University of Washington, 2Department of Bioengineering, Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine,University of Washington, 3Department of Medicine, Kidney Research Institute,University of Washington

Summary

Здесь мы представляем протокол для изготовления почечной коры внеклеточной матрицы производный гидрогеля сохранить родной почек внеклеточного матрикса (ECM) структурные и биохимический состав. Процесс изготовления и ее приложения описаны. Наконец обсуждаются перспективы использования этот Гидрогель для поддержки почек конкретной клеточной и тканевой регенерации и биоинженерии.

Abstract

Внеклеточная матрица (ECM) предоставляет важные биофизических и биохимических подсказки для поддержания гомеостаза ткани. Текущий синтетических гидрогели предлагают надежное механическое крепление в vitro клеточные культуры, но не хватает необходимых белков и лигандом состав вызывают физиологической поведение клеток. Эта рукопись описывает метод изготовления для почечной коры ECM-производные гидрогеля с правильной механической надежности и поддержки биохимического состава. Гидрогель изготовлен механической гомогенизации и растворяющие decellularized человеческая почка коры ECM. Матрица сохраняет соотношение белка родной почек корка ECM позволяя при этом гелеобразования в физиологических механическая жесткость. Гидрогель служит субстрата, на котором почек клетки коры производные может быть сохранен в физиологических условиях. Кроме того состав гидрогеля можно манипулировать для моделирования больной среде, которая позволяет будущего исследования заболеваний почек.

Introduction

Внеклеточная матрица (ECM) предоставляет важные биофизических и биохимических подсказки для поддержания гомеостаза ткани. Состав комплекса молекулярной регулирует структурные и функциональные свойства ткани. Структурные белки обеспечивают клетки с пространственной осведомленности и позволяют для адгезии и миграции1. Связанные лиганды взаимодействуют с поверхности рецепторы клеток контролировать поведение ячейки2. Почки ECM содержит множество молекул, состав и структура которого варьируется в зависимости от анатомического расположения, стадии развития и болезни состояние3,4. Изложив сложности ECM является ключевым аспектом в изучении клеток почек, полученных в пробирке.

Предыдущие попытки репликации ECM микросреды сосредоточились на decellularizing всей ткани для создания леса способны recellularization. Decellularization выступал с химическими чистящими средствами, например додецилового сульфата натрия (SDS) или неионных моющих средств, и он использует либо весь орган перфузии или погружения и агитации методы5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Подмости, представленные здесь сохранения структурных и биохимические сигналы в родной ткани ECM; Кроме того, recellularization с донорами конкретных клеток имеет клиническое значение в реконструктивной хирургии14,,1516,,1718, 19. Однако, эти леса не хватает структурной гибкости и поэтому несовместимы с многих текущих устройств, используемых для исследований в пробирке . Чтобы преодолеть это ограничение, многие группы далее перерабатывается decellularized ECM гидрогели20,21,,2223,24. Эти гидрогели совместимы с литья и bioink и обойти микрометра масштаба пространственные ограничения, которые decellularized место подмостей на клетки. Кроме того,3,25сохранились молекулярный состав и соотношение в родной ECM. Здесь мы демонстрируем способ изготовления гидрогеля, производный от почечной коры ECM (kECM).

Цель настоящего Протокола заключается в производить гидрогеля, который реплицирует микроокружения регионе кортикального слоя почек. Почечной ткани коры decellularized в 1% растворе SDS под постоянным агитации для удаления клеточной материи. SDS обычно используется для decellularize ткани из-за его способность быстро удалить иммунологические клеточного материала6,7,9,26. KECM затем подлежит механической гомогенизации и лиофилизации5,6,9,11,26. Солюбилизация в сильной кислоты с пепсин приводит к окончательной гидрогеля Стоковый раствор20,27. Родной kECM белки, которые важны для структурной поддержки и сигнала трансдукции сохранились3,25. Гидрогель можно также загущенное в в течение одного порядка величины родного человека почечной коры28,29,30. Эта матрица обеспечивает физиологические среду, которая была использована для сохранения покоя почек специфических клеток, по сравнению с гидрогели от других белков матрицы. Кроме того, состав матрицы можно манипулировать, например, путем добавления коллагена-I, чтобы модель болезни сред для исследования почек фиброз и других заболеваний почек31,32.

Protocol

Человеческие почки были изолированы LifeCenter северо-запада после этические принципы, установленные Ассоциацией орган закупок организаций. Этот протокол руководящими животных ухода и клетки культуры изложенные в университете штата Вашингтон. 1. Подготовка человека почечно…

Representative Results

Гидрогель kECM обеспечивает матрицу для культуры клеток почек с аналогичными химический состав как родной почек микроокружения. Для изготовления гидрогеля, почечной ткани коры механически изолированы от всей почек органа и нарезанные кубиками (рис. 1). D…

Discussion

Матрицы обеспечивают важные механические и химические сигналы, которые регулируют поведение клеток. Синтетические гидрогели способны поддержать комплекс 3-мерной патронирования, но не предоставляют разнообразные внеклеточные сигналы в физиологических матрица микросреды. Гидрогели…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы признать Линн и Майк Гарви Imaging лаборатории в институте стволовых клеток и регенеративной медицины и LifeCenter Северо-Запада. Они также хотели бы признать финансовой поддержке национальных институтов здравоохранения грантов, TR000504 UH2/UH3 (в. г.) и DP2DK102258 (для ВМФ), NIH T32 обучения Грант DK0007467 (R.J.N.) и неограниченный подарок от почек центров Северо-Запада Научно-исследовательский институт почек.

Materials

Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker Sigma-Aldrich Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 436143
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm) Fisher Science 14-512-128
500 mL Vacuum Filter VWR 97066-202
Stir Plate Sigma-Aldrich CLS6795420D
1000 mL Beaker Sigma-Aldrich CLS10031L
Forceps Sigma-Aldrich F4642 Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp Sigma-Aldrich Z168866
Dissecting Scissors Sigma-Aldrich Z265977
Scalpel Handle, No. 4 VWR 25859-000 Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20 VWR 25860-020 Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) Fisher Science 14-513-52
Absorbent Underpad VWR 82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm) Corning 430597
Autoclavable Biohazard Bag VWR 14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um) Fisher Science 22-363-547
Cell Culture Grade Water HyClone SH30529.03
30 mL Freestanding Tube VWR 89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine Polytron PCU-20110
Freeze Dryer Labconco 7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap Sigma-Aldrich V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm) Fisher Science 14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P7012
0.01 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530
15 mL Conical Tube ThermoFisher 339651
Cell Culture Media ThermoFisher 11330.032 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X Life Technologies 15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X Life Technologies 51300-044
1 mL Syringe Sigma-Aldrich Z192325
Microspatula Sigma-Aldrich Z193208
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
  2. Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
  3. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
  4. Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
  5. Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
  8. Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
  9. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  10. Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
  11. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
  12. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  13. Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  14. Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
  15. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  16. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  17. Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
  18. Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
  19. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  20. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  21. Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
  22. Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
  23. Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
  24. Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
  25. Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
  26. Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
  27. O’Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
  28. Streitberger, K. -. J., et al. High-resolution mechanical imaging of the kidney. Journal of Biomechanics. 47 (3), 639-644 (2014).
  29. Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
  30. Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
  31. Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis?. Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
  32. Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved?. Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
  33. Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
  34. Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
  35. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  36. Kim, M. -. S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
  37. Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
  38. Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
  39. Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
  40. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  41. Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
  42. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  43. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
  44. Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
  45. Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
  46. Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
  47. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  48. Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
  49. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  50. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials – Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  51. Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
  52. Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  53. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  54. Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D’Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
  55. Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
  56. Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
  57. Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
  58. Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
  59. Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
  60. Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).

Tags

Keywords: Kidney CortexExtracellular MatrixHydrogelBiomaterialsCell Matrix InteractionsSulfateSDS SolutionRenal CapsuleMedullary RegionDecellularizationCell StrainerBleachHomogenization
check_url/it/58314?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image