Isolamento degli epatociti primari del topo per l'analisi di sintesi della proteina nascente dal metodo di etichettatura Non radioattivo L-azidohomoalanine

Esam S.B. Salem; Kazutoshi Murakami; Toshimasa Takahashi; Elise Bernhard; Vishnupriya Borra; Mridula Bethi; Takahisa Nakamura

doi:10.3791/58323

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Articolo metodologico

Isolamento degli epatociti primari del topo per l'analisi di sintesi della proteina nascente dal metodo di etichettatura Non radioattivo L-azidohomoalanine

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DOI:

10.3791/58323

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23 ottobre 2018

Esam S.B. Salem^*¹^,² , Kazutoshi Murakami^*² , Toshimasa Takahashi² , Elise Bernhard² , Vishnupriya Borra² , Mridula Bethi² , Takahisa Nakamura²^,³^,⁴

¹Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, ²Division of Endocrinology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ⁴Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento degli epatociti primari del topo sano e funzionale. Istruzioni per la rilevazione sintesi epatica delle proteine nascenti dal substrato di etichettatura non radioattivo erano fornite per aiutarvi a comprendere i meccanismi alla base della sintesi proteica nel contesto dell'omeostasi del metabolismo energetico nel fegato.

Abstract

Gli epatociti sono cellule parenchimatiche del fegato e coinvolgere più funzioni metaboliche, tra cui la sintesi e la secrezione di proteine essenziali per l'omeostasi energetica sistemica. Epatociti primari isolati dal fegato murino costituiscono un prezioso strumento biologico per comprendere le proprietà funzionali o le alterazioni che si verificano nel fegato. Qui descriviamo un metodo per l'isolamento e la coltura di epatociti primari del topo eseguendo una tecnica di perfusione in due fasi della collagenosi ed discutere la loro utilizzazione per indagare il metabolismo delle proteine. Il fegato di un topo adulto in sequenza è irrorato con acido tetraacetico di glicole etilenico-bis (EGTA) e la collagenosi, seguita dall'isolamento degli epatociti con il buffer di gradienti di densità. Questi epatociti isolati sono vitali su piastre di coltura e mantengono la maggior parte delle caratteristiche dotate degli epatociti. Questi epatociti possono essere utilizzati per le valutazioni del metabolismo delle proteine tra cui sintesi proteica nascente con reagenti non radioattivo. Indichiamo che gli epatociti isolati sono facilmente controllati e comprendono una maggiore stabilità di qualità e volume di sintesi delle proteine legata al metabolismo energetico utilizzando la reazione di legatura chemo-selettive con una proteina di tetrametilrodamina (TAMRA) Metodo di rilevazione e analisi macchiantesi occidentali. Pertanto, questo metodo è prezioso per lo studio di sintesi epatica della proteina nascente collegata all'omeostasi energetica. Il seguente protocollo descrive i metodi per il rilevamento della sintesi proteica nascente e l'isolamento degli epatociti primari del topo di alta qualità e materiali.

Introduzione

La proteina è un elemento nutritivo importante e circa il 50% del peso secco del corpo umano è composto di proteine che hanno diversi tratti biologici e funzioni¹. Di conseguenza, la sintesi delle proteine è uno della maggior parte degli eventi che richiede energia e un'alterazione nel metabolismo delle proteine altamente è associata con lo sviluppo di malattie, tra cui malattie metaboliche²^,³^,⁴. Nel fegato, biosintesi della proteina rappresenta circa 20 – 30% del consumo totale di energia⁵^,⁶. ....