Entrega de gene lentiviral assistida por laser em óvulos fertilizados de camundongos
Summary
Mouse de ovos fertilizados e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene. Este artigo descreve um protocolo para perfurar a zona com um laser para transduce células embrionárias com vetores Lentivirus e criar ratos transgénicos.
Abstract
Lentivírus são eficientes vetores para entrega de gene em células de mamíferos. Seguindo a transdução, o genoma de Lentivirus estàvel é incorporado ao cromossomo do hospedeiro e é passado para a descendência. Assim, eles são vetores ideais para a criação de linhas de célula estável, na vivo entrega dos indicadores e transdução de ovos única célula fertilizada para criar animais transgénicos. No entanto, rato fertilizado ovos e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene Lentivirus. Lentivírus são demasiado grandes para penetrar a zona e são tipicamente entregues pela microinjeção de partículas virais em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias. O requisito para tecnólogos altamente qualificados e equipamentos especializados minimizou o uso do lentivírus para entrega de genes em embriões de rato. Este artigo descreve um protocolo para permeabilizing os ovos fertilizado de rato por perfurar a zona com um laser. Laser-perfuração não resulta em danos aos embriões e permite lentivírus ter acesso às células embrionárias para a entrega do gene. Transduzidas embriões podem desenvolver-se em blastocisto in vitro e se implantado em ratos pseudopregnant, evoluir para filhotes transgênicos. O laser utilizado neste protocolo é eficaz e fácil de usar. Genes, entregados por lentivírus estàvel incorporam em células embrionárias de rato e são transmissível germline. Este é um método alternativo para a criação de ratos transgênicos que requer sem micromanipulação e microinjeção de ovos fertilizados.
Introduction
Este método fornece instruções detalhadas para permeabilizing a zona pelúcida de ovos fertilizado de rato para tornar as células embrionárias acessível para a entrega do gene lentivírus. Lentivírus são projetados pela natureza para entrega eficiente de gene de células de mamíferos. Eles infectam células de divisão e não dividindo e integrarem o genoma de Lentivirus seu anfitrião cromossomos1. O intervalo de células hospedeiras Lentivirus prontamente é expandido por pseudotyping o lentivirus recombinante com a glicoproteína de vírus estomatite vesicular (VSV-G), devido a ampla tropismo do VSV-G proteínas2. Após transdução, Lentivirus genes são integrados estàvel e expressa como parte de seus cromossomos de acolhimento criando uma ferramenta ideal para a geração de animais transgênicos. Se entregue para células embrionárias de estágio inicial, o genoma Lentivirus é replicado e expresso em todo o organismo. Transdução de Lentivirus conduziu à produção de ratos, rato, galinha, codorna e porco3,4,5,6,7 , entre outras espécies de transgênicos. O método típico de entrega de Lentivirus gene, no entanto, requer técnicos especializados e equipamentos especializados para superar a barreira da zona pelúcida que encapsula os embriões adiantados do palco. O objectivo geral deste método é que descrevem como permeabilize a zona com um laser para facilitar a entrega de Lentivirus gene.
Ovos de mamíferos estão rodeados pela zona pelúcida que endurece após a fecundação para proteger os ovos fertilizados contra poliespermia e limitar a interacções ambientais8,9. A zona forma uma barreira que mantém os lentivírus longe as células embrionárias até que os embriões são incubados como um blastocisto. Mouse culta fertilizado ovos eclodem após 4 dias e deve ser implantado em ratos pseudopregnant antes da incubação para o desenvolvimento normal em filhotes. Portanto, para a transdução, lentivírus são injetadas antes da eclosão da zona em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias.
Muitas vezes, a zona pelúcida é removida para fertilização ” in vitro ” de ovos humanos para aumentar a taxa de fertilização10. No entanto, a remoção química de rato zona pelúcida negativamente afeta o desenvolvimento do embrião de rato e é prejudicial para as células embrionárias11,12. Outros métodos para a entrega do gene de ovos fertilizado de rato superar a barreira da zona pelúcida pelo microinjection direto do DNA para a célula núcleo13. Microinjeção pró-nuclear é um meio eficiente de entregar genes para embriões. No entanto, desde que cada embrião é mantido no lugar individualmente para microinjeção, a prática pode ser trabalhoso e demorado para um usuário iniciante.
Outros métodos como electroporation e photoporation são úteis para transiente e a curto prazo entrega de gene de rato fertilizado ovos14,15,16. Esses métodos são usados extensivamente para a entrega de recombinases e CRISPR-Cas9 componentes. No entanto, eletroporação e photoporation entrega de genes não pode ser usada com eficiência para criar transgênicos. Espermatozoides, que são coletadas do epidídimo de rato perfurado também podem ser transformados por lentivírus e utilizados para fertilização in vitro , para produzir animais transgénicos17,18,19, 20.
Neste protocolo, a entrega do gene Lentivirus de embriões do rato é facilitada pela permeabilizing a zona usando um laser. O laser de XYClone foi desenvolvido como um auxílio para em vitro fertilização21 e cultivo de células-tronco embrionárias22. É um pequeno aparelho que é simples de configurar e fácil de usar. Uma vez instalado em um microscópio, que ocupa o espaço de uma lente objetiva e o software que acompanha permite apontar o laser ao olhar através da ocular do microscópio (Veja o protocolo: seção 3). Uma vez que a zona é perfurada pelo laser XYClone, lentivírus podem ser introduzidos o meio de cultura para gene entrega23. Lentivírus múltiplas poderiam ser usados para entregar simultaneamente vários genes para incorporação cromossômica.
Este protocolo irá descrever como isolar e cultura mouse fertilizado ovos, ilustra o uso do laser para perfuração da zona pelúcida e demonstra a transdução de células embrionárias de rato por lentivírus.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade dos lentivírus para integrar o seu genoma hospedeiro torna um vetor ideal para a entrega do gene estável. Vetores de Lentivirus podem transportar até 8,5 mil par (kbp) de material genético que pode acomodar células específicas ou inducible promotores, marcadores de seleção ou partes fluorescentes. Material genómico incorporado pode replicar como parte de seu genoma do hospedeiro e ser regulamentado para expressar ou desactivar em pontos de tempo desejado. Estes vetores permitem spatiotemporal contro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de saúde (NIH), National Institute de Ciências de saúde ambiental (NIEHS). Nós estamos gratos ao Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams para leitura crítica do manuscrito e conselhos úteis. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Dr. Bernd Gloss, o núcleo de nocaute, a facilidade de citometria de fluxo, a microscopia de fluorescência e centro de imagem e as instalações da filial de medicina comparativa do NIEHS por suas contribuições técnicas. Gostaríamos de agradecer o Sr. David Goulding do ramo de medicina comparativa e MS. Lois Wyrick do centro de imagem no NIEHS para fornecer-nos com fotografias e ilustrações.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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