استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس
Summary
يصف هذا البروتوكول غرس نافذه زجاجيه علي الحبل الشوكي للماوس لتسهيل التصور بواسطة المجهر الانترافيتال.
Abstract
يصف هذا البروتوكول طريقه لاستئصال صفيحه الحبل الشوكي وغرس النوافذ الزجاجية لتصوير الحبل الشوكي للماوس في الجسم المجري . ويستخدم المبخر الرقمي المتكامل لتحقيق مستوي مستقر من التخدير بمعدل تدفق منخفض من الايزوفلواني. يتم أزاله عمود فقري واحد ، ويتم تراكب الغطاء الزجاجي المتاح تجاريا علي سرير رفيع. ثم تلصق الصفيحة الخلفية البلاستيكية المطبوعة ثلاثية الابعاد بالأشواك الفقرية المجاورة باستخدام لاصق الانسجه والاسمنت السني. يتم استخدام منصة التثبيت للحد من الحركة الملموسة من التنفس وضربات القلب. هذه الطريقة السريعة والخالية من المشبك مناسبه تماما لمجهر متعدد الفوتونات الحاد. يتم تضمين البيانات التمثيلية لتطبيق هذه التقنية علي اثنين من الفوتون المجهري من الاوعيه الدموية في الحبل الشوكي في الفئران المحورة وراثيا التعبير عن eGFP: العرج-5-بروتين تقاطع ضيق.
Introduction
النماذج الحيوانية المحورة وراثيا التعبير عن البروتينات الفلورية ، عندما يقترن مع المجهر الانترافيتال ، توفر منصة قويه لمعالجه علم الاحياء والفيزيولوجيا المرضية. لتطبيق هذه التقنيات علي الحبل الشوكي ، والبروتوكولات المتخصصة مطلوبه لاعداد الحبل الشوكي للتصوير. وتتمثل أحدي هذه الاستراتيجيات في اجراء عمليه استئصال الصفيحة الفقرية وغرس الحبل الشوكي. وتشمل الميزات الرئيسية للبروتوكول المثالي لاستئصال الصفيحة المجهرية الحفاظ علي بنيه الانسجه الاصليه ووظيفتها ، واستقرار حقل التصوير ، ووقت المعالجة السريع ، واستنساخ النتائج. ويتمثل أحد التحديات الخاصة في تحقيق الاستقرار في مجال التصوير مقابل الحركة المستحثة بالتنفس ونبض القلب. وقد تم الإبلاغ عن استراتيجيات متعددة السابقين وفي الجسم الفيفو لتحقيق هذه الأهداف1,2,3,4,5. معظم في الأساليب المجرية تنطوي علي لقط الجانبين من العمود الفقري2,4 وغالبا ما يعقبه زرع جهاز معدني جامد3,4 للاستقرار اثناء الجراحة تطبيقات التصوير النهائي. لقط العمود الفقري يمكن ان يضر بتدفق الدم والحث علي أعاده عرض البروتين حاجز الدم في الدماغ (BBB).
والغرض من هذا الأسلوب هو جعل الحبل الشوكي سليمه متاحه للتصوير البصري في الماوس الحية مع التقليل من غزو البروتوكول وتحسين النتائج. ونحن وصف استئصال الصفيحة واحده والغطاء الزجاجي الاجراء غرس يقترن البيضاوي الحد الأدنى من البلاستيك 3D-مطبوعه الخلفية التي لا تزال تحقق الاستقرار الميكانيكية القوية. يتم التزام باللوحة الخلفية مباشره بالعمود الفقري الامامي والخلفي مع الاسمنت السني. وقد تم تجهيز اللوحة الخلفية مع أذرع التمديد الجانبية مع ثقوب المسمار التي نعلق بشكل صارم علي مرحله المجهر عن طريق ذراع معدنيه. هذا المراسي بشكل فعال الفقرة الاماميه والخلفية السليمة إلى مرحله المجهر ، وتوفير المقاومة الميكانيكية للقطع المصنوعة الحركة التي لولا ذلك سيتم إدخالها عن طريق التنفس وضربات القلب. وقد تم تحسين هذه الطريقة لاستئصال الصفيحة الفقرية لفقره واحده في المستوي الصدري 12 ، وحذف المشابك المستخدمة في استراتيجيات بديله للاستقرار اثناء التصوير في الجسم المجري . الاجراء سريع ، أخذ ما يقرب من 30 دقيقه لكل ماوس.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أليات الامراض من BBB. و BBB هو نظام الاوعيه الدقيقة الديناميكية التي تتالف من الخلايا البطانية, العضلات الملساء الاوعيه الدموية, pericytes, وعمليات القدم تموت التي توفر بيئة انتقائية للغاية للجهاز العصبي المركزي (CNS). البيانات التمثيلية تصور تطبيق هذا البروتوكول في الفئران المحورة وراثيا المهندسة للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP): العرج-5 ، وهو البروتين تقاطع الضيق BBB. يمكن أيضا تخصيص ملفات الطباعة الخلفية المتوفرة للتطبيقات البديلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا تسمح للتصوير مستقره من الحبل الشوكي في الفئران من خلال نافذه زجاجيه. وقد تم تطبيق هذه الطريقة لتقييم BBB أعاده عرض في eGFP المحورة وراثيا: Claudin5 +/-الفئران التي تعبر عن الفلورية BBB البروتين مفرق ضيق ، ولكن يمكن تطبيقها بشكل جيد علي قدم المساواة للدراسات من اي البروتينات الفل…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم S.E. لوتس من قبل المركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية, المعاهد الوطنية للصحة, تحت منحه KL2TR002002 وجامعه إلينوي شيكاغو كليه الطب بدء الأموال. ويدعم سيمون الفورد من قبل RO1 MH084874. المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمعاهد القومية للصحة. ويشكر المؤلفان دراتان اغاليو في قسم علم الأعصاب في المركز الطبي بجامعه كولومبيا لأجهزه الفئران التي تعمل بالرنين العصبي الليفي: كلوبين-5 ، والمناقشات العلمية ، والرؤى في تطوير البروتوكول الجراحي وتطبيقات التصوير. ويشكر المؤلفون سونيل ب. غاندي في قسم بيولوجيا الأعصاب والسلوك في جامعه كاليفورنيا ، ايرفين لتصميم النموذج الاولي للجهاز المجسم ووحده تحكم درجه الحرارة الحيوانية ، ومناقشه البروتوكول الجراحي ، التدريب في المجهر الثنائي الفوتون. ويشكر المؤلفون أيضا ستيف بيكنز (w. Nuhsbaum, Inc.) للحصول علي المساعدة في تخصيص المجسم الفراغي الجراحي ، و Ron Lipinski (صناعه الحيتان) للأجزاء المجسمة بالقطع.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
