Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis
Summary
Dit protocol beschrijft implantatie van een glas venster op het ruggenmerg van een muis om visualisatie te vergemakkelijken door intravital microscopie.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode voor de implantatie van het ruggenmerg en de glazen ruit voor in vivo beeldvorming van het ruggenmerg van de muis. Een geïntegreerde digitale vaporizer wordt gebruikt om een stabiel vlak van anesthesie te bereiken bij een laag debiet van isoflurane. Er wordt een enkele wervel wervelkolom verwijderd en een in de handel verkrijgbare afdekglas wordt op een dun agarose bed gelegd. Een 3D-gedrukte kunststof achterplaat wordt vervolgens aangebracht op de aangrenzende wervel stekels met behulp van weefsellijm en tand cement. Een stabilisatie platform wordt gebruikt om bewegings artefact te verminderen van ademhaling en hartslag. Deze snelle en Clamp-Free methode is zeer geschikt voor acute multi-photon fluorescentiemicroscopie. Representatieve gegevens zijn opgenomen voor een toepassing van deze techniek op twee-Fobe microscopie van de ruggenmerg-vasculatuur in transgene muizen die eGFP uitdrukken: Claudin-5 — een strak koppelings eiwit.
Introduction
Transgene diermodellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken, in combinatie met intravital microscopie, bieden een krachtig platform voor het aanpakken van biologie en pathofysiologie. Om deze technieken toe te passen op het ruggenmerg zijn gespecialiseerde protocollen vereist om het ruggenmerg voor te bereiden op beeldvorming. Een dergelijke strategie is het uitvoeren van een laminectomie en de implantatie van het ruggenmerg venster. De belangrijkste kenmerken van een ideaal laminectomie protocol voor microscopie omvatten behoud van native weefselstructuur en functie, stabiliteit van het beeldvormings veld, snelle verwerkingstijd en reproduceerbaarheid van resultaten. Een bijzondere uitdaging is om het beeldvormings veld te stabiliseren tegen de beweging geïnduceerd door ademhaling en hartslag. Er zijn meerdere ex vivo -en in vivo -strategieën gerapporteerd om deze doelen te bereiken1,2,3,4,5. De meeste in vivo -methoden omvatten het klemmen van de zijkanten van de wervelkolom2,4 en wordt vaak gevolgd door het implanteren van een rigide metalen apparaat3,4 voor stabiliteit tijdens chirurgie en downstreambeeldverwerkings toepassingen. Klemmen van de wervelkolom kan potentieel compromitteren bloedstroom en induceren bloed-hersen barrière (BBB) eiwit remodelleren.
Het doel van deze methode is om het intacte ruggenmerg beschikbaar te maken voor optische beeldvorming in de levende muis, terwijl de invasiviteit van het protocol wordt geminimaliseerd en de resultaten worden verbeterd. We beschrijven een enkele laminectomie en Cover-Glass implantatie procedure gecombineerd met een minimaal invasieve ovale kunststof 3D-gedrukte achterplaat die nog steeds robuuste mechanische stabiliteit bereikt. De achterplaat wordt direct aan de voorste en achterste wervel stekels met tand cement gehecht. De achterplaat is uitgerust met laterale verlengarmen met schroefgaten die stevig aan de Microscoop worden bevestigd via een metalen arm. Dit verankert effectief de intact voorste en posterieure wervel tot de Microscoop fase, het verstrekken van mechanische weerstand tegen het bewegings artefact dat anders zou worden geïntroduceerd door de ademhaling en hartslag. De methode is geoptimaliseerd voor laminectomie van een enkele wervel op thoracische niveau 12, weglaten van de klemmen gebruikt in alternatieve strategieën voor stabiliteit tijdens in vivo beeldvorming. De procedure is snel, met ongeveer 30 minuten per muis.
Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van de ziekte-mechanismen van de BBB. De BBB is een dynamisch microvasculaire systeem bestaande uit endotheel cellen, vasculaire gladde spieren, pericytes, en astrociet voet processen die zorgen voor een zeer selectieve omgeving voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Representatieve gegevens beschrijven de toepassing van dit protocol in transgene muizen die zijn ontwikkeld om verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) uit te drukken: Claudin-5, een BBB-strakke Junction-proteïne. De geleverde achterplaat print bestanden kunnen ook worden aangepast voor alternatieve toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele beeldvorming van het ruggenmerg bij muizen door middel van een glazen ruit. Deze methode is toegepast om BBB-remodellering in transgene eGFP te beoordelen: Claudin5 +/-muizen die een fluorescerende BBB-nauwe Junction-eiwit uitdrukken, maar het zou even goed kunnen worden toegepast voor studies van fluorescerende eiwitten of cellen in het ruggenmerg.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het stabiliseren van laminectomie en ruggenmerg. Alle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het nationaal centrum voor de bevordering van translationele wetenschappen, National Institutes of Health, onder Grant KL2TR002002 en University of Illinois Chicago College of Medicine start-up fondsen Simon Alford wordt ondersteund door RO1 MH084874. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH. De auteurs bedanken Dritan Agalliu in het departement Neurology van Columbia University Medical Center voor de TG eGFP: Claudin-5 muizen, wetenschappelijke discussies, en inzichten in de ontwikkeling van de chirurgische protocol en imaging toepassingen. De auteurs bedanken Sunil P. Gandhi in het departement neurobiologie en gedrag aan de Universiteit van Californië, Irvine voor het ontwerpen van het eerste prototype van het stereo-apparaat en de controller voor dier temperatuur, bespreking van het chirurgische protocol, en training in Two-photon microscopie. De auteurs bedanken ook Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) voor hulp bij het aanpassen van de chirurgische stereomicroscoop, en Ron Lipinski (walvis productie) voor het bewerken van stereotactische onderdelen.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
