כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר השרשה של חלון זכוכית אל חוט השדרה של העכבר כדי להקל על ההדמיה על ידי המיקרוסקופיה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח חוט השדרה והשרשה חלון זכוכית עבור vivo הדמיה של חוט השדרה של העכבר. מאדה דיגיטלית משולבת מנוצל כדי להשיג מישור יציב של הרדמה בקצב נמוך בזרימה של isofלוריאן. עמוד שדרה אחד בחוליות מוסר, וזכוכית כיסוי מסחרית זמינה מצופה על מיטה דקה. הרקע פלסטיק 3D מודפס לאחר מכן מודבקת את השדרה השדרה הסמוכה באמצעות דבק רקמה ושיניים מלט. פלטפורמת ייצוב משמש כדי להפחית את התנועה מתוך נשימה ודופק. שיטה מהירה ונטולת מלחציים זו מתאימה היטב למיקרוסקופיה חריפה מרובת פוטון. נתונים מייצגים כלולים עבור יישום של טכניקה זו לשני פוטון המיקרוסקופיה של חוט השדרה ומיקרולטורה בעכברים טרנסגניים המבטא eGFP: קלאודין-5 – חלבון הצומת צר.
Introduction
דגמי החיות הטרנסגניים מבטאים חלבונים פלורסצנט, כאשר הם משולבים עם מיקרוסקופ אינטרטל, מספקים פלטפורמה רבת עוצמה לטיפול בביולוגיה ופתופסולוגיה. כדי להחיל טכניקות אלה על חוט השדרה, פרוטוקולים מיוחדים נדרשים להכין את חוט השדרה עבור הדמיה. אסטרטגיה אחת כזו היא לבצע כריתת למינציה והשתלת חלון חוט השדרה. התכונות המרכזיות של פרוטוקול כריתת למינציה אידיאלית למיקרוסקופיה כוללות שימור מבנה ותפקוד של רקמות מקוריות, יציבות של שדה ההדמיה, זמן עיבוד מהיר ושלילת תוצאות. אתגר מסוים הוא לייצב את שדה ההדמיה נגד התנועה הנגרמת על ידי נשימה ודופק. מספר vivo ex ואסטרטגיות vivo דווחו כדי להשיג את המטרות הללו1,2,3,4,5. רוב בשיטות vivo כרוכות לאורך הדרך בעמוד השדרה2,4 ולעתים קרובות לאחר מכן על ידי השתלת מנגנון מתכת נוקשה3,4 עבור יציבות במהלך הניתוח ו יישומי דימות במורד הזרם. לחיץ את עמוד השדרה יכול להתפשר על זרימת הדם ולגרום דם-מוח מחסום (BBB) שיפוץ חלבון.
מטרת שיטה זו היא להפוך את חוט השדרה שלמים זמין לדימות אופטי בעכבר החי תוך מזעור הפלישה של הפרוטוקול ושיפור התוצאות. אנו מתארים כריתת למינציה אחת וכיסוי השתלת זכוכית הליך לזווג עם מינימלית פולשנית האליפסה 3d מודפס מתכתי שעדיין משיגה יציבות מכנית חזקה. לוחית הגיבוי היא דבקה ישירה השדרה הקדמית והאחורי החוליות עם מלט שיניים. הלוחית האחורית מצוידת בזרועות הארכה לרוחב עם חורי בורג שמתחברים באופן נוקשה לשלב המיקרוסקופ דרך זרוע מתכת. זה מעגן ביעילות את החוליה הקדמית והאחורי ללא שינוי לשלב המיקרוסקופ, מתן עמידות מכנית לחפץ התנועה שאחרת הוכנסו על ידי נשימה ודופק. השיטה ממוטבת עבור כריתת למינציה של חוליה אחת ברמת בית החזה 12, השמטת את התפסים מנוצל אסטרטגיות חלופיות ליציבות במהלך הדמיה vivo . ההליך הוא מהיר, לוקח כ 30 דקות לכל עכבר.
פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר מנגנוני המחלות של BBB. Bbb הוא מערכת דינמית מיקרוסקולרית מורכבת של תאים אנדותל, שריר חלק כלי הדם, קרום הלב, ו אסטרוציט ברגל תהליכים המספקים סביבה סלקטיבית מאוד עבור מערכת העצבים המרכזית (cn). נתונים מייצגים מתארים את היישום של פרוטוקול זה בעכברים טרנסגניים הנדסה לבטא חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP): קלאודין 5, חלבון BBB צר הצומת. ניתן גם להתאים אישית את קבצי ההדפסה מלוח הרקע עבור יישומים חלופיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה יציבה של חוט השדרה בעכברים דרך חלון זכוכית. שיטה זו הוחל על הערכת שיפוץ BBB ב-הטרנסגניים eGFP: Claudin5 +/-עכברים המבטאים חלבון מהיר BBB הצומת צר, אבל זה יכול להיות מיושם גם היטב למחקרים של חלבונים פלורסנט או תאים בחוט השדרה.
פותחו מספר שיטות לניתוח למינצ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. לוץ נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום המדעים הטרנסלאומיים, המכון הלאומי לבריאות, תחת גרנט KL2TR002002 ואוניברסיטת אילינוי שיקגו המכללה להתחלת הרפואה. סיימון Alford נתמך על ידי RO1 MH084874. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH. המחברים מודים לdritan Agalliu במחלקה לנוירולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה, עבור העכברים Tg-5, הידברות המדעית והתובנות לגבי פיתוח הפרוטוקול הכירורגי ויישומי ההדמיה. המחברים מודים סוניל P. גנדי במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות באוניברסיטת קליפורניה, אירווין לעיצוב האבטיפוס הראשון של מנגנון הסטריאוטקטיקה ובקר בעלי החיים, דיון בפרוטוקול הכירורגי ו אימונים. במיקרוסקופיה של שתי פוטון המחברים גם מודים לסטיב פיקנס (Nuhsbaum, Inc) לקבלת סיוע בהתאמה אישית של stereomicroscope כירורגי, רון ליפסקי (ייצור לוויתן) לעיבוד חלקי סטריאוטקטיקה.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
