माउस में लेमिनेक्टॉमी और स्पाइनल कॉर्ड विंडो प्रत्यारोपण
Summary
इस प्रोटोकॉल intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य की सुविधा के लिए एक माउस की रीढ़ की हड्डी पर एक कांच की खिड़की के प्रत्यारोपण का वर्णन करता है.
Abstract
यह प्रोटोकॉल माउस रीढ़ की हड्डी की विवो इमेजिंग में रीढ़ की हड्डी laminectomy और कांच खिड़की प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन करता है. एक एकीकृत डिजिटल vaporizer isoflurane की एक कम प्रवाह दर पर संज्ञाहरण के एक स्थिर विमान को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक एकल कशेरुकी रीढ़ हटा दिया जाता है, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कवर ग्लास एक पतली agarose बिस्तर पर मढ़ा है. एक 3 डी मुद्रित प्लास्टिक backplate तो ऊतक चिपकने वाला और दंत सीमेंट का उपयोग कर आसन्न कशेरुक रीढ़ के लिए चिपका है. एक स्थिरीकरण मंच श्वसन और दिल की धड़कन से गति कलाकृति को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह तेजी से और क्लैम्प मुक्त विधि तीव्र बहु-फोटोन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। प्रतिनिधि डेटा इस तकनीक के एक आवेदन के लिए शामिल किए गए हैं ट्रांसजेनिक चूहों में रीढ़ की हड्डी vascualture के दो-photon माइक्रोस्कोपी eGFP व्यक्त:Claudin-5 – एक तंग जंक्शन प्रोटीन.
Introduction
ट्रांसजेनिक पशु मॉडल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, जब intravital माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, जीव विज्ञान और pathophysiology को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करते हैं. रीढ़ की हड्डी के लिए इन तकनीकों को लागू करने के लिए, विशेष प्रोटोकॉल इमेजिंग के लिए रीढ़ की हड्डी तैयार करने के लिए आवश्यक हैं। ऐसी ही एक रणनीति एक laminectomy और रीढ़ की हड्डी खिड़की प्रत्यारोपण का संचालन करने के लिए है. माइक्रोस्कोपी के लिए एक आदर्श laminectomy प्रोटोकॉल की प्रमुख विशेषताओं देशी ऊतक संरचना और समारोह के संरक्षण, इमेजिंग क्षेत्र की स्थिरता, जल्दी प्रसंस्करण समय, और परिणामों की reproducibility शामिल हैं. एक विशेष चुनौती श्वसन और दिल की धड़कन से प्रेरित गति के खिलाफ इमेजिंग क्षेत्र को स्थिर करने के लिए है। इनलक्ष्योंको प्राप्त करने के लिए अनेक पूर्व विवो और विवो रणनीतियों की सूचना दी गई है. विवो विधियों में अधिकांश रीढ़ की हड्डी के कॉलम2,4 के पक्षों clamping शामिल है और अक्सर एक कठोर धातु उपकरण प्रत्यारोपण द्वारा पीछा किया जाता है3,4 सर्जरी के दौरान स्थिरता के लिए और डाउनस्ट्रीम इमेजिंग अनुप्रयोगों. रीढ़ की हड्डी स्तंभ दबाना संभावित रक्त प्रवाह समझौता कर सकते हैं और रक्त मस्तिष्क बाधा प्रेरित (BBB) प्रोटीन remodeling.
इस विधि का उद्देश्य प्रोटोकॉल के आक्रामकता को कम करते हुए और परिणामों में सुधार करते हुए जीवित माउस में ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए बरकरार रीढ़ की हड्डी उपलब्ध कराना है। हम अभी भी मजबूत यांत्रिक स्थिरता प्राप्त करता है कि एक न्यूनतम इनवेसिव अंडाकार अंडाकार प्लास्टिक 3 डी मुद्रित backplate के साथ रखा एक एकल laminectomy और कवर ग्लास प्रत्यारोपण प्रक्रिया का वर्णन. बैकप्लेट को सीधे दंत सीमेंट के साथ पूर्वकाल और पीछे की कशेरुकी रीढ़ का पालन किया जाता है। बैकप्लेट पेंच छेद के साथ पार्श्व विस्तार हथियारों से सुसज्जित है जो एक धातु हाथ के माध्यम से माइक्रोस्कोप चरण को सख्ती से संलग्न करता है। यह प्रभावी रूप से माइक्रोस्कोप चरण के लिए बरकरार पूर्वकाल और पीछे कशेरुक लंगर, गति कलाकृति है कि अन्यथा श्वसन और दिल की धड़कन द्वारा पेश किया जाएगा करने के लिए यांत्रिक प्रतिरोध प्रदान करते हैं. विधि वक्ष स्तर 12 पर एक कशेरुक के laminectomy के लिए अनुकूलित किया गया है, vivo इमेजिंग में स्थिरता के लिए वैकल्पिक रणनीतियों में उपयोग clamps omitting. प्रक्रिया तेजी से है, माउस प्रति लगभग 30 मिनट ले रही है.
इस प्रोटोकॉल BBB के रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. BBB एक गतिशील microvascular प्रणाली endothelial कोशिकाओं के शामिल है, संवहनी चिकनी मांसपेशियों, pericytes, और astrocyte पैर प्रक्रियाओं है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के लिए एक अत्यधिक चयनात्मक वातावरण प्रदान करते हैं. प्रतिनिधि डेटा ट्रांसजेनिक चूहों में इस प्रोटोकॉल के आवेदन को दर्शाती बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर (eGFP):Claudin-5, एक BBB तंग जंक्शन प्रोटीन. प्रदान की backplate मुद्रण फ़ाइलें भी वैकल्पिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि यहाँ वर्णित एक गिलास खिड़की के माध्यम से चूहों में रीढ़ की हड्डी के स्थिर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. इस विधि transgenic eGFP में BBB remodeling का आकलन करने के लिए लागू किया गया है:Claudin5 +/- चूहों कि एक फ्लोरोसेंट BBB तंग …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एस.ई. Lutz अनुदान KL2TR002002 और इलिनोइस शिकागो कॉलेज ऑफ मेडिसिन स्टार्ट-अप फंड के तहत, अनुवाद विज्ञान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित है। साइमन Alford RO1 MH084874 द्वारा समर्थित है. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी NIH के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. लेखकों Tg eGFP के लिए कोलंबिया विश्वविद्यालय के चिकित्सा केंद्र में न्यूरोलॉजी विभाग में Dritan Agalliu धन्यवाद:Claudin-5 चूहों, वैज्ञानिक विचार विमर्श, और शल्य प्रोटोकॉल और इमेजिंग अनुप्रयोगों के विकास में अंतर्दृष्टि. लेखकों ने कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में न्यूरोबायोलॉजी और व्यवहार विभाग में सुनील पी. दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी में प्रशिक्षण। लेखकों को भी शल्य स्टीरियोमाइक्रोस्कोप को अनुकूलित करने में सहायता के लिए स्टीव Pickens (डब्ल्यू Nuhsbaum, इंक) धन्यवाद, और रॉन Lipinski (Whale विनिर्माण) stereotactic भागों मशीनिंग के लिए.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
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