マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植
Summary
このプロトコルは、マウスの脊髄にガラス窓を移植し、生体内顕微鏡による視覚化を容易にすることを説明する。
Abstract
このプロトコルは、マウス脊髄の生体内イメージングのための脊髄ラミネクトミーおよびガラス窓移植のための方法を説明する。統合されたデジタル気化器はイソロルランの低流量で麻酔の安定した平面を達成するために利用される。単一の脊椎が取り除かれ、市販のカバーガラスが薄いアガロースのベッドの上に重ね合わされる。3Dプリントされたプラスチックバックプレートは、組織接着剤と歯科セメントを使用して隣接する椎体脊椎に貼り付けられます。安定化プラットフォームは、呼吸と心拍からモーションアーティファクトを減らすために使用されます。この急速でクランプフリーの方法は急性多光子蛍光顕微鏡検査に適している。代表的なデータは、eGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける脊髄血管系の2光子顕微鏡検査に対して、この技術を適用するために含まれる:Claudin-5 – タイトな接合タンパク質である。
Introduction
蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルは、生体内顕微鏡と組み合わせることで、生物学および病態生理学に対処するための強力なプラットフォームを提供する。これらの技術を脊髄に適用するには、脊髄をイメージング用に準備するために特別なプロトコルが必要です。そのような戦略の1つは、ラミンクトミーと脊髄窓の移植を行う。顕微鏡検査のための理想的なラミネクトミープロトコルの主な特徴は、ネイティブ組織の構造と機能の保存、イメージング分野の安定性、迅速な処理時間、および結果の再現性を含みます。特に課題は、呼吸と心拍によって引き起こされる運動に対してイメージングフィールドを安定させることです。複数のex vivoとインビボ戦略は、これらの目標1、2、3、4、5を達成するために報告されています。生体内の方法のほとんどは、脊柱2、4の側面を締め付け、しばしば手術中の安定性のために堅い金属装置3、4を埋め込むことが続く。ダウンストリームイメージングアプリケーション。脊柱を締め付けると、血流を損なう可能性があり、血液脳関門(BBB)タンパク質リモデリングを誘発する可能性があります。
この方法の目的は、プロトコルの侵襲性を最小限に抑え、結果を改善しながら、生きているマウスの光学イメージングのために無傷の脊髄を利用できるようにすることです。我々は、まだ堅牢な機械的安定性を達成する最小限に侵襲的な楕円形のプラスチック3Dプリントバックプレートと組み合わせた単一のラミネクトミーとカバーガラスの注入手順を説明します。バックプレートは歯科セメントが付いている前部および後脊柱に直接付着する。バックプレートは金属の腕によって顕微鏡の段階に堅く付着するねじ穴が付いている横延長腕が装備されている。これは、無傷の前椎骨と後椎骨を顕微鏡段階に効果的に固定し、呼吸と心拍によって導入される運動アーティファクトに機械的抵抗を提供します。この方法は、胸部レベル12で単一椎骨のラミネクトミーのために最適化されており、生体内イメージング中の安定性のための代替戦略で利用されるクランプを省略する。この手順は、マウスあたり約30分を取って、迅速です。
このプロトコルは、BBBの疾患メカニズムを研究するために使用することができる。BBBは、内皮細胞、血管平滑筋、ペリサイト、および星状の足のプロセスからなる動的な微小血管系であり、中枢神経系(CNS)に高度に選択的な環境を提供します。代表的なデータは、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP):Claudin-5、BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するように設計されたトランスジェニックマウスにおけるこのプロトコルの適用を示す。提供されるバックプレート印刷ファイルは、代替用途用にカスタマイズすることもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、ガラス窓を介してマウスにおける脊髄の安定的なイメージングを可能にする。この方法は、蛍光BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するトランスジェニックeGFP:Claudin5+/-マウスにおけるBBBリモデリングを評価するために適用されているが、脊髄内の蛍光タンパク質または細胞の研究にも同様に適用できる。
ラミネクトミーと脊髄安定化のた?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E.Lutzは、グラントKL2TR002002とイリノイ大学シカゴ医科大学のスタートアップファンドの下で、翻訳科学を進める国立センター、国立衛生研究所によってサポートされています。サイモン・アルフォードはRO1 MH084874によってサポートされています。コンテンツは著者の責任のみであり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。著者らは、コロンビア大学医療センターの神経学科のドリタン・アガリューに感謝しています:Claudin-5マウス、科学的な議論、および外科的プロトコルとイメージングアプリケーションの開発に関する洞察。著者らは、カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学と行動学科のSunil P. Gandhiに感謝し、立体装置と動物温度コントローラの最初のプロトタイプを設計し、外科的プロトコルの議論を行い、2光子顕微鏡検査の訓練。著者らはまた、外科立体顕微鏡のカスタマイズを支援するスティーブ・ピッケンズ(W.Nuhsbaum, Inc.)と、立体部品を加工するためのロン・リピンスキー(ホエール・マニュファクチャリング)に感謝しています。
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
