마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식
Summary
이 프로토콜은 쥐의 척수에 유리 창을 이식하여 분사 내 현미경 검사법에 의한 시각화를 용이하게 합니다.
Abstract
이 프로토콜은 마우스 척수의 생체 내 이미징을 위한 척수 하구 절제술 및 유리 창 이식방법을 기술한다. 통합 된 디지털 기화기는 이소플루란의 낮은 유량에서 마취의 안정적인 평면을 달성하기 위해 활용된다. 단일 척추척추가 제거되고 시판되는 커버 글래스가 얇은 아가로즈 침대에 겹쳐져 있습니다. 3D 인쇄 플라스틱 백플레이트는 조직 접착제 및 치과 시멘트를 사용하여 인접한 척추 척추에 부착됩니다. 안정화 플랫폼은 호흡과 심장 박동에서 모션 아티팩트를 줄이기 위해 사용됩니다. 이 신속하고 클램프가없는 방법은 급성 다중 광자 형광 현미경 검사법에 적합합니다. 대표적인 데이터는 eGFP:Claudin-5 -단단한 접합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에서 척수 혈관의 2광자 현미경 검사법에 이 기술의 적용을 위해 포함된다.
Introduction
형광성 단백질을 발현하는 형질전환 동물 모델은 분과내 현미경 검사법과 결합될 때 생물학 및 병리생리학을 해결하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 기술을 척수에 적용하려면 척수를 이미징을 위해 특수 프로토콜이 필요합니다. 그러한 전략 중 하나는 라민 절제술과 척수 창 이식을 수행하는 것입니다. 현미경 검사법을 위한 이상적인 laminectomy 프로토콜의 주요 특징은 네이티브 조직 구조 및 기능의 보존, 화상 진찰 필드의 안정성, 빠른 처리 시간 및 결과의 재현성을 포함합니다. 특별한 도전은 호흡과 심장 박동에 의해 유도된 운동에 대하여 화상 진찰 필드를 안정시키는 것입니다. 여러 ex vivo 및 생체 내 전략은 이러한 목표를 달성하기 위해보고되었다1,2,3,4,5. 대부분의 생체 내 방법은 척추2,4의 측면을 클램핑하는 것을 포함하고 종종 수술 중 안정성을 위해 경질 금속 장치3,4를 이식하고 다운스트림 이미징 애플리케이션. 척추를 고정하면 잠재적으로 혈류를 손상시키고 혈액 -뇌 장벽 (BBB) 단백질 리모델링을 유도 할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 프로토콜의 침략을 최소화하고 결과를 개선하면서 살아있는 마우스에서 광학 이미징에 사용할 수있는 그대로 척수를 만드는 것입니다. 우리는 여전히 강력한 기계적 안정성을 달성 최소 침습 타원형 플라스틱 3D 인쇄 백 플레이트와 결합 한 단일 laminectomy 및 커버 유리 이식 절차를 설명합니다. 백플레이트는 치과 시멘트가있는 전방 및 후방 척추 척추에 직접 부착됩니다. 백플레이트에는 금속 암을 통해 현미경 스테이지에 단단히 부착되는 나사 구멍이 있는 측면 확장 암이 장착되어 있습니다. 이것은 효과적으로 현미경 단계에 온전한 전방 및 후방 척추를 고정하고, 그렇지 않으면 호흡과 심장 박동에 의해 소개될 운동 아티팩트에 기계적 저항을 제공합니다. 이 방법은 흉부 수준 12에서 단일 척추의 하구 절제술에 최적화되어 생체 내 이미징 중 안정성을 위한 대체 전략에 사용되는 클램프를 생략합니다. 절차는 마우스 당 대략 30 분 취하는, 급속합니다.
이 프로토콜은 BBB의 질병 기전을 연구하는데 사용될 수 있다. BBB는 중추 신경계 (CNS)에 대한 매우 선택적 환경을 제공하는 내피 세포, 혈관 평활근, pericytes 및 성상 세포 발 과정으로 구성된 동적 미세 혈관 시스템입니다. 대표적인 데이터는 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP):클라우딘-5, BBB 단단한 접합 단백질을 발현하도록 설계된 형질전환 마우스에서 이 프로토콜의 적용을 묘사한다. 제공된 백플레이트 인쇄 파일은 대체 응용 프로그램에 맞게 사용자 지정할 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 유리 창을 통해 마우스에서 척수의 안정적인 이미징을 허용합니다. 이 방법은 형광 BBB 단단한 접합 단백질을 발현하는 형질전환 eGFP:Claudin5+/- 마우스에서 BBB 리모델링을 평가하기 위하여 적용되었습니다, 그러나 척수에 있는 어떤 형광성 단백질 또는 세포의 연구 결과를 위해 동등하게 잘 적용될 수 있었습니다.
라민 절제술과 척수 안정화를위한 여러 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz는 그랜트 KL2TR002002 및 일리노이 대학 시카고 의과 대학 창업 기금에 따라 국립 번역 과학, 국립 보건원, 국립 연구소의 지원을 받고 있습니다. 사이먼 알포드는 RO1 MH084874에 의해 지원됩니다. 이 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 TG eGFP에 대한 컬럼비아 대학 의료 센터의 신경학과에서 Dritan Agalliu 감사합니다: 클라우딘-5 마우스, 과학적 토론, 수술 프로토콜 및 이미징 응용 프로그램의 개발에 대한 통찰력. 저자는 캘리포니아 대학의 신경 생물학 및 행동학과의 Sunil P. Gandhi에게 감사하고, 어바인은 입체 적 장치 및 동물 온도 컨트롤러의 첫 번째 프로토 타입을 설계하고, 수술 프로토콜에 대한 논의, 2 광자 현미경 검사법에서 훈련. 저자는 또한 수술 입체 현미경을 사용자 정의에 도움을 스티브 피켄스 (W. Nuhsbaum, Inc.) 감사, 론 리핀스키 (고래 제조) 입체 부품을 가공.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
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