Summary
Denne protokollen beskriver implantation av et glass vindu på ryggmargen på en mus for å lette visualisering av intravital mikroskopi.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode for ryggmargen laminectomy og glass vindu implantation for in vivo Imaging av musen ryggmargen. En integrert Digital fordamper er benyttet for å oppnå et stabilt fly av anestesi på en lav-flow rate av isoflurane. En enkelt vertebrale ryggraden er fjernet, og en kommersielt tilgjengelig cover-glass er kledde på en tynn agarose seng. En 3D-trykt plast bakplate er deretter festet til tilstøtende vertebrale pigger ved hjelp av vev lim og Dental sement. En stabiliserings plattform brukes til å redusere bevegelses gjenstanden fra åndedrett og hjerterytme. Denne raske og klemme-fri metoden er velegnet for akutt multi-Foton fluorescens mikroskopi. Representative data er inkludert for bruk av denne teknikken til to-Foton mikroskopi i ryggmargen blodkar i transgene mus som uttrykker eGFP: Claudin-5-et stramt knutepunkt protein.
Introduction
Transgene dyremodeller som uttrykker fluorescerende proteiner, kombinert med intravital mikroskopi, gir en kraftig plattform for adressering av biologi og patofysiologi. For å bruke disse teknikkene i ryggmargen, er spesialiserte protokoller som kreves for å forberede ryggmargen for Imaging. En slik strategi er å gjennomføre en laminectomy og en rygg mARGs implantat. De viktigste funksjonene i en ideell laminectomy protokoll for mikroskopi inkluderer bevaring av Native vev struktur og funksjon, stabilitet av tenkelig feltet, rask behandlingstid, og reproduserbarhet av resultater. En spesiell utfordring er å stabilisere bildefeltet mot bevegelsen indusert av åndedrett og hjerterytme. Flere ex vivo – og in vivo -strategier er rapportert for å oppnå disse målene1,2,3,4,5. De fleste in vivo metoder innebære klemme sidene av ryggsøylen2,4 og blir ofte etterfulgt av implanting et stivt metall apparat3,4 for stabilitet under kirurgi og nedstrøms bildebehandlingsprogrammer. Klemme på ryggsøylen kan potensielt kompromittere blodstrømmen og indusere blod-hjerne barriere (BBB) protein remodeling.
Hensikten med denne metoden er å gjøre intakt ryggmargen tilgjengelig for optisk tenkelig i levende mus samtidig minimere invasiveness av protokollen og forbedre utfall. Vi beskriver én enkelt laminectomy og en implantat prosedyre for dekkglass som er koblet sammen med en minimalt invasiv oval plast 3D-trykt bakplate som fortsatt oppnår robust mekanisk stabilitet. Bakplaten er direkte overholdt de fremre og bakre vertebrale pigger med Dental sement. Bakplaten er utstyrt med lateral forlengelsesarmer med skrue hull som strengt festes til mikroskopet scenen via en metall arm. Dette forankrer effektivt intakt fremre og bakre vertebra til mikroskopet scenen, noe som gir mekanisk motstand mot bevegelse gjenstand som ellers ville bli innført av åndedrett og hjerterytme. Metoden er optimalisert for laminectomy av en enkelt vertebra på bryst nivå 12, og utelater klemmene benyttet i alternative strategier for stabilitet under in vivo Imaging. Prosedyren er rask, tar ca 30 min per mus.
Denne protokollen kan brukes til å studere sykdoms mekanismer av BBB. Den BBB er en dynamisk mikrovaskulær system bestående av endothelial celler, vaskulær glatt muskel, pericytes, og astrocytt foten prosesser som gir et svært selektivt miljø for sentralnervesystemet (CNS). Representative data avbilder anvendelsen av denne protokollen i transgene mus konstruert for å uttrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP): Claudin-5, en BBB stramt veikryss protein. De med følgende utskrifts filene for bakplate kan også tilpasses for alternative bruksområder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet her gir mulighet for stabil avbildning av ryggmargen i mus gjennom et glass vindu. Denne metoden har blitt brukt for å vurdere BBB remodeling i transgene eGFP: Claudin5 +/-mus som uttrykker et fluorescerende BBB stramt knutepunkt protein, men det kan brukes like godt for studier av noen fluorescerende proteiner eller celler i ryggmargen.
Flere metoder for laminectomy og rygg mARGs stabilisering er utviklet. Alle protokoller adresse stabilisere ryggmargen under Imaging og vin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz er støttet av National Center for fremmarsj translational Sciences, National Institutes of Health, under Grant KL2TR002002 og University of Illinois Chicago College of Medicine oppstart midler. Simon Alford er støttet av RO1 MH084874. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle utsikten over NIH. Forfatterne takker Dritan Agalliu ved Institutt for Nevrologi ved Columbia University Medical Center for TG eGFP: Claudin-5 mus, vitenskapelige diskusjoner, og innsikt i utviklingen av kirurgisk protokoll og tenkelig applikasjoner. Forfatterne takker Sunil P. Gandhi i Department of nevrobiologi and Behavior ved University of California, Irvine for å designe den første prototypen av stereotactic apparater og dyr temperatur kontroller, diskusjon av kirurgisk protokoll, og opplæring i to-Foton mikroskopi. Forfatterne takker også Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) for å få hjelp til å tilpasse kirurgiske stereomikroskopet, og Ron Sandbech (Whale Manufacturing) for maskinering stereotactic deler.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
