Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши
Summary
Этот протокол описывает имплантацию стеклянного окна на спинной мозг мыши для облегчения визуализации с помощью внутривитой микроскопии.
Abstract
Этот протокол описывает метод для ламинэктомии спинного мозга и имплантации стекла окна для in vivo изображения спинного мозга мыши. Интегрированный цифровой испаритель используется для достижения стабильной плоскости анестезии при низкой скорости потока изолюран. Удаляется один позвоночник позвонка, а на тонкой агарозной кровати накладывается коммерчески доступное крышка. 3D-печатной пластиковой задней панели затем крепится к соседним позвоночника моль с помощью ткани клея и зубного цемента. Платформа стабилизации используется для уменьшения артефакта движения от дыхания и сердцебиения. Этот быстрый и без зажимов хорошо подходит для острой мультифотоновой флуоресценции микроскопии. Репрезентативные данные включены для применения этого метода к двухфотонической микроскопии сосуды спинного мозга у трансгенных мышей, выражающих eGFP:Claudin-5 – плотный протеин соединения.
Introduction
Трансгенные модели животных, выражающие флуоресцентные белки, в сочетании с интравитальной микроскопией, обеспечивают мощную платформу для решения биологии и патофизиологии. Чтобы применить эти методы к спинному мозгу, специальные протоколы необходимы для подготовки спинного мозга для визуализации. Одной из таких стратегий является проведение имплантации ламинэктомии и окна спинного мозга. Ключевыми особенностями идеального протокола ламинэктомии для микроскопии являются сохранение структуры и функции родной ткани, стабильность поля изображения, быстрое время обработки и воспроизводимость результатов. Особая задача заключается в стабилизации поля изображения против движения, вызванного дыханием и сердцебиением. Несколько ex vivo и in vivo стратегии, как сообщается, для достижения этихцелей 1,2,3,4,5. Большинство методов in vivo включают зажим сторонпозвоночника2,4 и часто сопровождается имплантированием жесткого металлического аппарата3,4 для стабильности во время операции и приложения для визуализации ниже по течению. Зажим позвоночника может потенциально поставить под угрозу кровоток и вызвать гематоэнцефалический барьер (BBB) белка ремоделирования.
Цель этого метода состоит в том, чтобы сделать неповрежденный спинной мозг доступным для оптической визуализации в живой мыши, минимизируя инвазивность протокола и улучшая результаты. Мы описываем одну процедуру имплантации ламинэктомии и крышки стекла в паре с минимально инвазивной овальной пластиковой 3D-печатной задней панелью, которая все еще достигает надежной механической стабильности. Задняя панель непосредственно прилипает к передней и задней позвоночника с зубным цементом. Задняя панель оснащена боковыми удлинительными руками с винтовыми отверстиями, которые жестко прикрепляются к стадии микроскопа через металлическую руку. Это эффективно якоря нетронутыми переднего и заднего позвонка на стадии микроскопа, обеспечивая механическое сопротивление движения артефакт, который в противном случае были бы введены дыхание и сердцебиение. Метод был оптимизирован для ламинэктомии одного позвонка на грудном уровне 12, опуская зажимы, используемые в альтернативных стратегиях стабильности во время in vivo изображений. Процедура быстрая, принимая приблизительно 30 минут в мышь.
Этот протокол может быть использован для изучения механизмов заболевания BBB. BBB является динамической микрососудистой системы, состоящей из эндотелиальных клеток, сосудистой гладкой мышцы, перицитов и астроцитов ноги процессов, которые обеспечивают весьма селективную среду для центральной нервной системы (ЦНС). Представительные данные изображают применение этого протокола в трансгенных мышах, разработанных для выражения повышенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP):Claudin-5, плотный белок соединения BBB. Предоставленные файлы печати задней панели также могут быть настроены для альтернативных приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод позволяет стабильно сделать визуализацию спинного мозга у мышей через стеклянное окно. Этот метод был применен для оценки BBB ремоделирования в трансгенных eGFP: Claudin5 /- мышей, которые выражают флуоресцентный BBB плотный белок соединения, но он может быть применен один…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz поддерживается Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения под руководством Гранта KL2TR002002 и начального медицинского фонда Чикагского медицинского колледжа. Саймона Алфорда поддерживает RO1 MH084874. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH. Авторы благодарят Дритан Agalliu в кафедре неврологии в Колумбийском университете медицинский центр для Tg eGFP: Claudin-5 мышей, научных дискуссий, а также понимание развития хирургического протокола и изображений приложений. Авторы благодарят Сунила. Ганди на кафедре нейробиологии и поведения Калифорнийского университета в Ирвине за разработку первого прототипа стереотаксического аппарата и контроллера температуры животных, обсуждение хирургического протокола и обучение двухфотонной микроскопии. Авторы также благодарят Стива Пикенса (W. Nuhsbaum, Inc.) за помощь в настройке хирургического стереомикроскопа и Рона Липински (Производство китов) за обработку стереотактических деталей.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
