Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón
Summary
Este protocolo describe la implantación de una ventana de vidrio en la médula espinal de un ratón para facilitar la visualización mediante microscopía intravital.
Abstract
Este protocolo describe un método para la laminectomía de la médula espinal y la implantación de ventanas de vidrio para la toma de imágenes in vivo de la médula espinal del ratón. Un vaporizador digital integrado se utiliza para lograr un plano estable de anestesia a una velocidad de bajo flujo de isoflurano. Se retira una sola columna vertebral, y se superpone un vidrio de cubierta disponible comercialmente en un lecho de agarosa delgada. A continuación, se fija una placa posterior de plástico impresa en 3D a las espinas vertebrales adyacentes utilizando adhesivo tisular y cemento dental. Se utiliza una plataforma de estabilización para reducir el artefacto de movimiento de la respiración y los latidos del corazón. Este método rápido y libre de abrazaderas es adecuado para la microscopía aguda de fluorescencia multifotón. Se incluyen datos representativos para la aplicación de esta técnica a la microscopía de dos fotones de la vasculatura de la médula espinal en ratones transgénicos que expresan eGFP:Claudin-5 — una proteína de unión apretada.
Introduction
Los modelos animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes, cuando se combinan con la microscopía intravital, proporcionan una potente plataforma para abordar la biología y la fisiopatología. Para aplicar estas técnicas a la médula espinal, se requieren protocolos especializados para preparar la médula espinal para la toma de imágenes. Una de esas estrategias es llevar a cabo una laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal. Las características clave de un protocolo de laminectomía ideal para la microscopía incluyen la preservación de la estructura y función del tejido nativo, la estabilidad del campo de la imagen, el tiempo de procesamiento rápido y la reproducibilidad de los resultados. Un desafío particular es estabilizar el campo de imagen contra el movimiento inducido por la respiración y los latidos del corazón. Múltiples estrategias ex vivo e in vivo han sido reportadas para alcanzar estos objetivos1,2,3,4,5. La mayoría de los métodos in vivo implican sujetar los lados de la columna vertebral2,4 y a menudo es seguido por la implantación de un aparato metálico rígido3,4 para la estabilidad durante la cirugía y aplicaciones de imágenes posteriores. Sujetar la columna vertebral puede comprometer potencialmente el flujo sanguíneo e inducir la remodelación de proteínas de barrera hematoencefálica (BBB).
El propósito de este método es hacer que la médula espinal intacta esté disponible para imágenes ópticas en el ratón vivo, minimizando al mismo tiempo la invasividad del protocolo y mejorando los resultados. Describimos una sola laminectomía y un procedimiento de implantación de vidrio de cubierta combinado con una placa posterior impresa en 3D de plástico ovalada mínimamente invasiva que todavía logra una estabilidad mecánica robusta. La placa posterior se adhiere directamente a las espinas vertebrales anteriores y posteriores con cemento dental. La placa posterior está equipada con brazos de extensión lateral con orificios de tornillo que se fijan rígidamente a la etapa del microscopio a través de un brazo metálico. Esto ancla eficazmente la vértebra anterior y posterior intacta a la etapa del microscopio, proporcionando resistencia mecánica al artefacto de movimiento que de otro modo sería introducido por la respiración y los latidos del corazón. El método ha sido optimizado para la laminectomía de una sola vértebra a nivel torácico 12, omitiendo las abrazaderas utilizadas en estrategias alternativas de estabilidad durante la imagen in vivo. El procedimiento es rápido, tardando aproximadamente 30 minutos por ratón.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la BBB. El BBB es un sistema microvascular dinámico compuesto por células endoteliales, músculo liso vascular, pericitos y procesos de pie astrocito que proporcionan un ambiente altamente selectivo para el sistema nervioso central (SNC). Los datos representativos describen la aplicación de este protocolo en ratones transgénicos diseñados para expresar proteína fluorescente verde mejorada (eGFP):Claudin-5, una proteína de unión estrecha BBB. Los archivos de impresión de placa posterior proporcionados también se pueden personalizar para aplicaciones alternativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí permite imágenes estables de la médula espinal en ratones a través de una ventana de vidrio. Este método se ha aplicado para evaluar la remodelación de BBB en ratones transgénicos eGFP:Claudin5+/- que expresan una proteína fluorescente de unión estrecha BBB, pero podría aplicarse igualmente bien para estudios de cualquier proteína fluorescente o células en la médula espinal.
Se han desarrollado múltiples métodos para la laminectomía y estabilización de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz cuenta con el apoyo del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, los Institutos Nacionales de Salud, bajo los fondos de inicio de Grant KL2TR002002 y University of Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford es compatible con RO1 MH084874. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. Los autores agradecen a Dritan Agalliu en el Departamento de Neurología del Centro Médico de la Universidad de Columbia por los ratones Tg eGFP:Claudin-5, discusiones científicas e ideas sobre el desarrollo del protocolo quirúrgico y las aplicaciones de imagen. Los autores agradecen a Sunil P. Gandhi en el Departamento de Neurobiología y Comportamiento de la Universidad de California, Irvine por diseñar el primer prototipo del aparato estereotáctico y controlador de temperatura animal, la discusión del protocolo quirúrgico, y formación en microscopía de dos fotones. Los autores también agradecen a Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) por su ayuda en la personalización del estereomicroscopio quirúrgico, y a Ron Lipinski (Whale Manufacturing) por el mecanizado de piezas estereotácticas.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Riferimenti
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