이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조
Summary
여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .
Abstract
인공 항 원 제시 세포 (aAPC)는 T 세포를 자극 하는 강력한 능력으로 인해 면역 변조에 대 한 유망한 플랫폼입니다. Acellular 기판 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 정밀 제어 및 aAPC 표면 조절 T 세포와의 상호 작용의 물리적 속성을 포함 하는 셀 기반 aAPC에 비해 주요 장점을 제공 합니다. 비 등방성 입자에서 건설 aAPC 특히 타원 입자 자극 T 세포 증가 바인딩 및 T 세포에 사용할 수 있는 더 큰 표면 영역에 구형 들 문의 또한 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 로 일반적인 이해 및 향상 된 pharmacokinetic 속성 감소. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고도 광범위 하 게 구현 하 고 사용할 reproducibly 도전적 일 수 있다 박막 스트레칭과 같은 비 등방성 입자를 생성의 방법 허용.
이 위해, 우리는 가변 크기, 모양, 생 분해성 비 등방성 입자 기반 aAPC의 급속 하 고, 표준화 된 제조에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 T 세포 확장 비보 전 또는 vivo에서함께 하는 방법에 대 한 프레 젠 테이 션을 신호 그들의 크기, 형태, 및 표면 단백질 콘텐츠, 특성 및 그들의 기능을 평가 하기 위해. 이방성 aAPC 날조에이 접근은 확장 가능 하 고 재현성, 이상적 aAPC “상용” immunotherapies에 대 한 생성.
Introduction
그들은 강력한 항 원 특정 T 세포 응답을 생성할 수 있기 때문에 인공 항 원 제시 세포 (aAPC) immunomodulatory 대리인으로 약속으로 나타났습니다. 이러한 플랫폼에 필수적인 그들의 능력을 효율적으로 T 세포 활성화에 대 한 중요 한 신호를 제시 있습니다. 그들은 쉽게 하 고 적은 비용이 많이 드는 조작, 스케일 업 및 번역, 중 적은 직면 및 세포 기반 치료와 관련 된 위험을 완화 하기 때문에 acellular aAPC 셀 기반 aAPC에 매력적인 대안 있습니다. Acellular aAPC는 또한 높은 정도의 제어 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 및 T 세포1인터페이스 표면의 물리적 특성에 대 한 수 있습니다.
aAPC는 2 개의 신호 T 세포 활성화에 대 한 필수 최소를 정리 해야 합니다. 신호 1 항 원 인식 하며 T 세포 수용 체 (TCR)를 인식 하 고 I 또는 II 베어링의 동족 항 원 TCR 복잡 통해 신호에 culminating MHC 클래스와 함께 종사 하는 경우에 발생 합니다. 항 원 특이성 요구 하지 않아도, aAPC 시스템은 종종 agonistic 단일 클론 항 체를 nonspecifically TCR 복잡 한 자극 CD3 수용 체에 대 한 부담. MHC, 특히 MHC multimers의 재조합 형태도 제공 하는 항 원 특이성2,3를 aAPC의 표면에 사용 되었습니다. 신호 2는 T 세포의 활동을 지휘 한 costimulatory 신호가 이다. T 세포 활성화에 필요한 costimulation를 하려면 CD28 수용 체는 일반적으로 자극 agonistic aAPC 표면에 항 체와 다른 costimulatory 수용 체 4-1BB 등 성공적으로 대상된4있다 지만. 1 및 2 신호 단백질은 일반적으로 합성 aAPC 엄밀한 입자의 표면에 움직일 수 있습니다. 역사적으로, aAPC 폴리스 티 렌4,5 와 철 dextran6을 포함 하 여 물자의 다양 한에서 조작 되어 있다. 폴 리 유산 공동 glycolic acid ()와 같은 생 분해성 고분자를 활용 하는 새로운 시스템 (PLGA)을 단백질 신호를 쉽게 결합 될 수 있다, 직접 관리에서 vivo에서, 적합의 지속적인된 출시를 촉진할 수 있다 aAPC 생성 하 cytokines 또는 T 세포 활성화7,8을 증가 시키기 위해 수용 성 요소를 캡슐화.
필요한 신호 단백질의 존재 뿐만 아니라 aAPC/T 세포 상호 작용 하는 동안 충분히 큰 표면 영역 수용 체 참여 T 세포 활성화를 위해 필수적 이다. 따라서, 크기와 모양이 같은 aAPC의 물리적 매개 변수 크게 사용할 수 있는 그들의 접촉 영역을 변경 하 고 T 세포를 자극 하는 그들의 기능에 영향을 미칠. 미크론 크기 aAPC 그들의 nanoscale 대응9,10보다 T 세포 자극에 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 그러나, 나노 aAPC 우수한 biodistribution와 마이크로 aAPC11에 그들의 성능에서을 vivo에서 향상 시킬 수 있습니다 림프절에 더 나은 배수 장치를 가질 수 있습니다. 모양은은 aAPC 입자 기반 시스템에 대 한 관심의 또 다른 변수 이다. 이방성 aAPC 최근 대상 세포 감소 일반적인 셀 글귀와 결합 하 여 향상 된 상호 작용 때문에 주로 자극 T 세포에서 등방성 입자 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 셀 우선적으로 타원 입자의 긴 축에 바인딩할 고 큰 반지름 곡률 및 아첨 표면 aAPC T 셀12사이의 더 많은 접촉. 타원 입자의 긴 축에는 먹어서를, 증가 순환 시간 관리12,13 vivo에서 다음 구형 입자에 비해 결과 또한 낙담 한다. 이러한 이점 때문에 타원 입자는 효과 관찰 마이크로 및 nanoscales12, 항 원 특정 T 세포에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 , 구형 입자에 비해의 큰 확장 중재 13. 비 등방성 입자를 조작 하는 다양 한 전략이 있다 하지만 박막 스트레칭 방법은 간단 하 고 널리 허용 다양 한 입자 모양14의 범위를 생성 하는 데 사용. 합성, 다음 입자 영화에 캐스팅 되며 입자 물자의 유리 전이 온도 이상의 온도에서 하나 또는 두 개의 크기에 기지개. 영화는 입자를 검색 하려면 다음 해산 된다. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고 조작 입자 기반 aAPC에 대 한 현재 접근은 주로 등방성 시스템 및 입자 모양 변경 방법 구현 하기 어려운, 호환 되지 않는 특정 aAPC 합성 수 전략, 그리고 부족 정밀도 재현성15. 우리의 박막 스트레칭 기법 수동으로 수행 하거나 빠르게 다양 한 생 분해성 고분자 합성 비 등방성 입자 생성을 자동화 된 방식에서 하나 또는 두 개의 크기15에서 원하는 종횡비를 뻗어 될 수 있습니다.
우리의 이전 작품을 바탕으로, 우리는 생 분해성 입자 기반 접근 방식을 개발 결합 기술로 확장 가능한 박막 스트레칭 빠르게 T 셀 확장 비보 전 또는 에 대 한 표준화 된 방식 aAPC 가변 크기와 형태를 생성 하 vivo. 주는이 aAPC 시스템 유연성의 높은 수준의 원하는 밀도, 입자 표면에 carboxyl 그룹에 관심의 모든 protein(s) 하 우리의 단백질 활용 전략을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 크기, 형태, 및 표면 단백질, aAPC의 콘텐츠를 특성화 하 고 그들의 기능에서 생체 외에서평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 면역 세포 vivo 전 또는 vivo에서 immunotherapeutic 응용 프로그램의 다양 한 확장을 쉽게 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 이방성 고분자 입자의 정확한 세대에 대 한 다양 한 방법을 자세히 설명합니다. 여기서 설명 하는 기술 스트레칭 박막 확장성, 높은 재현성 및 저렴 한입니다. 비 등방성 입자를 생성 하기 위한 대체 기술 높은 비용, 낮은 처리량, 그리고 제한 된 입자 크기를 포함 하 여 많은 한계에서 고통. 박막 접근 스트레칭 또한 유리 입자 합성, 후 이방성 되도록 수정 때문에 이며, 결과적으로 다?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EBA (DGE-1746891)와 KRR (DGE-1232825) NSF 대학원 연구 친교 프로그램을 지원 위한 감사합니다. RAM 국가 연구 서비스 상 NIH NCI F31 감사 (F31CA214147)와 지원을 위해 대학 과학자 들은 친목을 위한 성과 보상. 저자 감사 NIH (R01EB016721 및 R01CA195503), 방지 실명 제임스와 캐롤 무료 카 탈 수상, 연구 및 지원에 대 한 암 Immunotherapy JHU 블룸버그 Kimmel 연구소.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
Riferimenti
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